全11件 ( 1 〜 11 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

少しがっかり 削除/引用 No.1563-11 - 2009/11/20 (金) 22:03:11 - ぽすどく ＞Mooさん 　なるほど、そうですか。ひょっとしたらと思うことが一つあったのですが、勘違いだったようです。すみません。

(無題) 削除/引用 No.1563-10 - 2009/11/20 (金) 11:56:55 - Moo ぽすどく様 ありがとうございます． しかしながら， F0もF1も，さらにその後に生まれてきた「不思議なへテロマウス」もサザンで確認していますが，F1も「不思議なヘテロマウス」もWTと変異アリルとのheteroです． 交配したWTのネズミは，マウスの供給会社から購入しているので，strainは問題ないと思われ，Creは入っていないと思います．「不思議なヘテロマウス」についてもCreが入っていないのを確認しています．

ひょっとしたら・・・ 削除/引用 No.1563-9 - 2009/11/20 (金) 05:28:23 - ぽすどく 　ひょっとして、 ＞F1とFLPマウスとかけた時に 　このF1マウスは「loxp-目的遺伝子-loxp-FRT-Neo-FRT-loxp」に関してhomozygousではないでしょうか。（もちろんF1という表現と矛盾はするのですが） 　あるいは、このF1マウスの先祖をさかのぼって見た場合に、どこかの時点でなんらかのCreマウスと交配されていたことはないですか？（これもF1という表現と矛盾しますが） 　もし、上記のような場合、少し思い当たることがあるのですが。

(無題) 削除/引用 No.1563-8 - 2009/11/19 (木) 12:29:37 - AP 産物には1コピーのloxPがのこっただけということでしょうか。 だとしたら、姉妹染色体間での相同組換え修復を考えなくても（それであっても可能でしょうが）、単純に二重鎖切断がloxP1とloxP3間で、いわゆるMMEJ (Microhomology-mediated end joining) されたという説明で足りそうです。

(無題) 削除/引用 No.1563-7 - 2009/11/19 (木) 10:21:39 - Moo AP様 ありがとうございます． genotypingのPCR産物をsequenceしたところ，あたかもCreをかけたかのようにloxP1とloxp3の間で完全にとんでいました．

(無題) 削除/引用 No.1563-6 - 2009/11/17 (火) 12:03:16 - AP 証明不能な問題に、想像に想像を重ねるのは無駄といわれるかもしれませんが、こういう現象は結構興味があるので、、、 こういうコンフィギュレーションから --loxP1-gene-loxP2-FRT1-neo-FRT2-loxP3-- こういうプロダクトを生じたということでしょうか。 --loxP-FRT-loxP3-- 可能性のひとつとして、二重鎖切断後のギャップ修復が、sister-chromatid間での組換え修復で起こったというのはどうでしょう。 姉妹染色体A上で、FRTのつなぎ換えの失敗で二重鎖切断、末端の削れ込みでがギャップ(.....)がこんな風に生じて、 これがintactな姉妹染色体BのloxP2-FRT1領域を鋳型に組換え修復された。 A. --loxP1-....................-FRT2-loxP3-- B. --loxP1-gene-loxP2-FRT1-neo-FRT2-loxP3-- あるいはAではFRTのFlip-outは完了したところで、Bにgapが生じて、これがAのloxP2-FRT-loxP3領域を鋳型に組換え修復された。 A. -loxP1-gene-loxP2-FRT-loxP3-- B. -loxP1-..............-loxP3-- mutagenesisなんかしていると、予想外のコンフィギュレーションのプロダクトが出来てくることがよくありますが、 たいていは、二重鎖切断の修復エラーが原因（かどうかはわからないけれど、それ以外考えにくく、それで説明がつくものだ）だ思っています。

(無題) 削除/引用 No.1563-5 - 2009/11/16 (月) 12:43:15 - Moo AP様 ありがとうございます． ただ，コンストラクトの順番から考えると，この仮説は難しいような気がしますが…．

(無題) 削除/引用 No.1563-4 - 2009/11/15 (日) 19:03:34 - AP >不勉強で申し訳ありませんが，これって所謂microhomology NHEJとかalternative NHEJというものでしょうか？ 私もこの辺の最近の動向は勉強していなくて、そういう用語を知りませんでしたが（現象としては古くから知られていたと思いますが）、それに相当するようです。 二重鎖切断が起こると末端が削られることで、かなり広範囲まで影響が及ぶことがあるので（数kbから数十kb以上の欠失を伴うend-joiningとか）、十分に考えうるのではないかと思います。もちろん、証明するのは難しいかもしれませんが、結果からさかのぼって考えうる仮説のひとつとにするにはいいんじゃないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.1563-3 - 2009/11/14 (土) 23:31:26 - Moo AP様 ありがとうございます． 不勉強で申し訳ありませんが，これって所謂microhomology NHEJとかalternative NHEJというものでしょうか？ コンストラクトはloxp-目的遺伝子-loxp-FRT-Neo-FRT-loxpになっており，目的遺伝子は２つのloxpに囲まれ，NeoがFRTに囲まれ，その後ろにloxpがあります．Neoは2000 bp弱，目的遺伝子は500 bpです．それでも御指摘のような相同組換えがおこることはありますでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1563-2 - 2009/11/14 (土) 15:34:28 - AP 経験はないし、想像ですが DNAの二重鎖切断が起こると、切断末端付近と相補性のある配列からプライミングして組換え修復が起こります。このとき鋳型となるのは、姉妹染色体上や相同染色体上のカウンターパートであるのが普通ですが、カウンターパートでなくても近くに相同配列（これが比較的短くても起こりうる）のあるDNA鎖があればこれが使われることもあります。このため、カットアンドペースト型のトランスポゾンの離脱などで二重鎖切断が起こると、比較的高率で、不等交差様の現象が起こります。 おそらくコンストラクトは --loxP-FRT--FRT---loxP--- のようなコンフィギュレーションだとおもいます。 たとえば、FRT組換えのとき、たまたまFRT配列同士のつなぎ変えに失敗し、二重鎖切断の修復が、右のloxPの配列が左のloxPにプライミングすることによって起こったということは考えられないでしょうか。

FLPマウスでloxPが… 削除/引用 No.1563-1 - 2009/11/14 (土) 04:44:53 - Moo いつも勉強させていただいています． あるタンパクのストレートKOマウスがembryonic lethalだったので，コンディショナルKOマウスを作りました．targeting constructはCre/loxとFRT/FLPのsystemで作りました．F1のラインになった時に，FLPマウスと交配してFRTの間のneoをとばし，最終的にはflox/floxネズミができ，現在Creネズミとかけているところです．で，質問はここからで，F1とFLPマウスとかけた時に，何故か１匹だけ，neoだけじゃなくて，loxpにはさまれていた目的遺伝子もとばされているヘテロマウスが生まれてきてしまいました…．ちなみに，fl/flネズミについては，Southern blottingとPCRでgenotypingをして，PCR産物のシークエンスもして，配列については問題ないことを確認していますので，コンストラクト自体には問題ありません． FLPがloxpをとばすことって，どなたか経験ありますか？

全11件 ( 1 〜 11 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

---