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(無題) 削除/引用 No.1552-7 - 2009/11/17 (火) 19:46:01 - ami ＞ただ、現状では24時間ほどで脾臓細胞が死滅してしまう状態なので、サイトカインの放出は期待できませんよね。。。 （ヒント）Ｔ細胞以外は･･･

(無題) 削除/引用 No.1552-6 - 2009/11/17 (火) 19:37:31 - 免疫初心者 ＞Dさん 脾臓細胞が刺激がないと死んでいってしまうとは知りませんでした。 勉強になります。ありがとうございます。 現在測定しているサイトカインは、IL-12p70とIL-4です。 論文をみてみますと、これらのサイトカインは48〜72時間培養が一般的のようですね。 培養日数も検討してみたいと思います。 ただ、現状では24時間ほどで脾臓細胞が死滅してしまう状態なので、サイトカインの放出は期待できませんよね。。。

(無題) 削除/引用 No.1552-5 - 2009/11/16 (月) 10:28:57 - D Splenocyte精製後にOVA+死菌（結核菌か何かでしょうか）で再刺激しているとの事なので、vitroでの刺激については大丈夫そうですね。 培地に何も加えなければSplenocyteには何も刺激が入らない（＝増殖刺激、活性化刺激が入らないので死を待つのみです）ためにサイトカイン産生も見られない、という理解です。 また、1週間の培養、というのはそのサイトカイン定量実験ではスタンダードな刺激時間なのでしょうか・・・私の経験では、細胞を再刺激してサイトカイン産生を見る場合には長くても3日とかで見ている気がするのですが。1週間も培養しっぱなしだと、せっかく分泌されたサイトカインも分解されてしまっている、という事はないですか？一度、１〜３日とかで時間を振って定量してみる事をお勧めします。 それから、もし差支えなければそのサイトカインを記載して頂けると他の皆さんもコメントしやすいのではないでしょうか。サイトカイン定量なんて沢山の人がやっているはずですので、レアなサイトカインでも経験者がいらっしゃる気がします。

(無題) 削除/引用 No.1552-4 - 2009/11/13 (金) 11:39:23 - 免疫初心者 >amiさん、Dさん アドバイス有難うございます。 説明が不足しており申し訳ありません。 脾臓細胞を摘出後、培地にOVAと凍結乾燥死菌体を添加して1週間共培養を行いサイトカイン測定を行っています。(共培養時には2-MEも添加しております) 細胞を刺激しないと死んでいくというのは、培地成分のみでは生きられないということでしょうか？ また、OVAと水酸化アルミニウムゲルの腹腔内投与はマウスをTh2側に偏向させるために行ったことで、アレルギー状態という私の表現が間違っておりました。腹腔内投与は1週間間隔で2度行っていますが、これで偏向できているのでしょうか？ 初歩的な質問ばかりで申し訳ありません。

(無題) 削除/引用 No.1552-3 - 2009/11/13 (金) 10:08:40 - D amiさんの仰っているように、vitroで何かしらの刺激をしないと細胞は死にゆく一方です。それとも、培養系にOVAを添加しているんでしょうか？ さらに、これもamiさんの仰るようにOVA+水酸化アルミだけではただOVAを免疫しただけなので、OVAを鼻に投与するとかしないとアレルギーにはならないと思いますよ（この方法についてはあまり自信がないのでご自身で調べてみて下さい）。 それから、免疫系の細胞は増殖にシステインを必要とするので、S-S結合を切断する2-MEを培地に入れた方がいいと思います。ただ、これは上二つの問題が解決した後の話になりますが。 今細胞が何もサイトカイン出さず、死にまくってるのは刺激を与えてないからだと思います。

(無題) 削除/引用 No.1552-2 - 2009/11/12 (木) 22:23:12 - ami なんか刺激しないとみんな死にます。 ＞マウスの腹腔内にOVAと水酸化アルミニウムゲルを混ぜたものを投与し、アレルギー状態にしたマウス もし処置がこれだけだったら、アレルギー状態じゃないです。

マウス脾臓細胞の初代培養について 削除/引用 No.1552-1 - 2009/11/12 (木) 22:17:52 - 免疫ｓｙ 現在、マウスの腹腔内にOVAと水酸化アルミニウムゲルを混ぜたものを投与し、アレルギー状態にしたマウスから摘出した脾臓細胞を用いてサイトカイン測定を試みています。 マウスから脾臓を摘出後シリンジの柄で脾臓をつぶし、ナイロン性のメッシュを通した後0.16Mの塩化アンモニウムで赤血球の除去を行うというプロトコールで脾臓細胞を採取していますが、採取1週間後に測定してみるとサイトカインがほとんど放出されていませんでした。 トリパンブルーにて脾臓細胞を染色してみると、脾臓細胞採取直後は90％以上の生存率だったのが24時間後にはほとんど死んでしまっているようでした。 原因として、培地に添加しているFBSのロットが合っていないのではないかと考えているのですが、他に考えられる原因はありますでしょうか？ 培地はRPMI1640mediumにペニシリン・ストレプトマイシンと10％FBSを添加したものを使用しています。

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