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(無題) 削除/引用 No.1548-18 - 2009/11/14 (土) 04:39:14 - おお 思いついたのですが、細胞死のシグナルの最も下流のあたりで ブロックしてしまうと言うのがいいかもと思いました、 カスペース3や9が活性化してしまえば、もう細胞死という 図式が出来上がっているわけですから、それ以降の動きは 遺伝子発現とかタンパク発現の変化はあまり関係ない ように思えるからです。 つまり、何か薬剤処理して遺伝子発現やタンパク発現が変化して (場合によってはタンパクの活性が変化したり)それで、 細胞死のシグナルを発生させると考えるとカスペース3や9をブロック しても発現変化が見られるわけです。 まあネクローティックであればカスペースの阻害剤はちょっと 無理かもしれませんけど、、、カルパインやカテプシンのインヒビタ- とか使えるのかなぁ、、、、、

細胞骨格 削除/引用 No.1548-17 - 2009/11/13 (金) 21:48:38 - 骨骨 アクチンやチューブリンは細胞骨格だから それらが何らかによって（カスパーゼ等）分解されない限りは 死んだ細胞で見られてもおかしくないのではないでしょうか？ 逆に、GAPDHといった酵素等は常に作られなければいけないので 死んだ細胞では劇的に減少するといった変化がみられると思うんですが。

(無題) 削除/引用 No.1548-16 - 2009/11/13 (金) 17:38:10 - ふと c様 何が大きい話で、何が小さい話かはわかりませんが ＞たとえば免疫細胞染色とか実施すれば個々の細胞で蛋白質の発現などが分かるので、 それはFACSのことをおっしゃっているのでしょうか？ 仮にそうだとしたら、 ＞それと何か細胞の生死や状態を見られる指標がイメージでうまく重ね合わせとか出来れば、 そういうのあります。 それがどういうものか書くと長くなりますし、もし既に知っていらっしゃると手間なので お聞きしますが、 FACS解析、アネキシンV、PI染色など、ご存知でしょうか？ もし、ご存じないのであれば、 ＞それと何か細胞の生死や状態を見られる指標がイメージでうまく重ね合わせとか出来れば、 出来ても、もやもやするのです。 なぜかはこれまでに書いた内容にあるので割愛致します。 もしFACSをご存知ならば、どうやったら私のもやもやがとけると思われますか？ ご教授ください。

(無題) 削除/引用 No.1548-15 - 2009/11/13 (金) 12:56:07 - c 質問された方の疑念は、つまるところ、単に昔から繰り返し言われてきた生化学的な実験一般について回る問題点の議論の延長上にある小さなお話にすぎないとおもいます。これは別の研究手法を併用することで解決可能ではないでしょうか。私は生化学も細胞生物学も専門家ではないので具体的な解決策をしめすことはできませんが、たとえば生化学的にみると生死を含めて個々の細胞間の違いが分からなくなる欠点があるけれども、たとえば免疫細胞染色とか実施すれば個々の細胞で蛋白質の発現などが分かるので、それと何か細胞の生死や状態を見られる指標がイメージでうまく重ね合わせとか出来れば、質問者の方のモヤモヤはあるていど晴れるのではないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.1548-14 - 2009/11/13 (金) 10:33:52 - おお >[Re:13] ふとさんは書きました : > おお様 > > ＞アクチンはカスペースの基質になるというのがありますね。 > > このアクチンの分解が先か、目的のタンパク質の発現低下が先か・・・ > ちなみに私がトリパンブルー真っ青（かなり死の末期）細胞をウエスタンしたときは > 分解産物らしきもの見えずアクチンはちゃんとウエスタンで検出できました（興味があったのでやってみた）。 > > ちなみにその細胞はある薬剤をかけるとアポトーシスを起こすと言っている人の > 死んだ細胞でございます。 > > 逆に、これはアポトーシスではないということでしょうかねw あはは、そうかもしれません。本人にそう言ってやれば どう反応するでしょうかね、、、まけんかにならない範囲で、、、 多分知識的にはご存じと思いますが膜の透過性は比較的 初期におきますね。逆に言うとはりでつついてトリパンブルー でそまっても、アポトーシスのシグナルで膜がいたんでも 区別できないじゃんっていうことになります。 タンパクの量をかんがえると細胞が死んでしまった 状態での上り下がりって私は信用しません(mRNAも同様に) ただ脳死の判定みたいにそれがいつというと、、、、 ゆいつ信用するとしたら細胞が死ぬ直前のタンパク量を 反映しているだろうと思える時ですね。 アクチンとかきれだすと、内部標準は定量的にいみを 持たないので、定量的な指標というよりは、ある意味 死んでいく尺度程度のもののような気がします。 ただそんな状態でもカスペースの何番が活性化した とか、それによってその基質が切れたとか言う話は 出来るので、そういう時は一様何がしかのインターなる コントロールを置くのではないかと、、、、

(無題) 削除/引用 No.1548-13 - 2009/11/13 (金) 10:16:35 - ふと ねうろん様 ＞無意識に「じゃ細胞は元気なんだな」って考えがち というか、著者らは、 「タイムコース取って２時間後のやつは死んでるでしょ？（図１）でも１時間後のやつはそんなに（これがキモ）死んでないでしょ？（図１）そのサンプルをウエスタンしました。 ほら、アクチンがちゃんとして検出できるから細胞の活きはいい！！のです。 そのときに他の遺伝子を比較すると。。。。」 って元気です！！って根拠にしているような気がします。。。 c様 ＞細胞の生存率のデータを横に並べて おっしゃる通りです。それでも私が思うのは、細胞の生存率をどう表すか？というのと それに関連しますが、どう示されるかで、どの死のステージは変わると思いますが 例えば死んだ細胞がいるとして（多分示されるのは、より少ない死亡数） それはもう末期であって、タイムコースでその途中をサンプリングしたとしても ある遺伝子が低下したので死にました か 死にましたのである遺伝子が（分解とかで）低下しました のか よくわからないんですよねぇ。 おお様 ＞アクチンはカスペースの基質になるというのがありますね。 このアクチンの分解が先か、目的のタンパク質の発現低下が先か・・・ ちなみに私がトリパンブルー真っ青（かなり死の末期）細胞をウエスタンしたときは 分解産物らしきもの見えずアクチンはちゃんとウエスタンで検出できました（興味があったのでやってみた）。 ちなみにその細胞はある薬剤をかけるとアポトーシスを起こすと言っている人の 死んだ細胞でございます。 逆に、これはアポトーシスではないということでしょうかねw

(無題) 削除/引用 No.1548-12 - 2009/11/13 (金) 03:01:06 - おお >[Re:5] ねうろんさんは書きました : > 今、ちょうどそんな感じの、薬剤処理した細胞のWBの結果を眺めています。 > サンプル処理前に観察した所、コントロールと比較して、みるからに細胞の調子がおかしかったものです。 > （トリパンで染めてないですけど） > > んで今回のそのサンプルでは > Tubulinー変化無し > Actinー50%減少 > GAPDHー80%減少 > 他の検出したタンパク質達は変化無しから激減と様々と。 > アクチンはカスペースの基質になるというのがありますね。 カスペース活性化が関与している場合はレビューワーから ちくりとさされるかもしれません。 チューブリンに関しては分かりませんけど、、、、

(無題) 削除/引用 No.1548-11 - 2009/11/12 (木) 22:37:01 - c こうしたデータは、正確には単一の細胞のなかの様子を表しているのでなく、ある細胞集団の全体像を示しているわけです。生きてる細胞と死んでる細胞をきれいに分けられるならば、それぞれで見てもいいですが、生細胞死細胞の混在が避けられないような場合は、細胞の生存率のデータを横に並べて、後は論文の読み手に判断してもらうということではダメでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.1548-10 - 2009/11/12 (木) 17:57:43 - ねうろん 横レスに横レス失礼致します >[Re:7] 中年さんは書きました : > その可能性は大いにあると思います。そう言う状況ならもっと細かくタイムコースを取ってみたいところです。 同意しますw でもこれがまたセンスがいりますよね。。。 前回0-6-24hをさて今回どうするか、、、 トピ主様の質問に対して答えになっていないかもですが、私の実験、パスウェイの場合、トピ主様の仮定の中の方々と同じで、細胞死を想定しておりません（あくまで今回の結果は二次的な現象として想定しております。現時点で。つまり見たい現象は細胞死ではありません。）。ですので今後の予定は まず必要最低限の濃度でタイムコース 減った（or増えた）遺伝子のover-expression と knock-down という流れになると思います。 しかし結果次第ではやはり細胞死を見なければ、という考え、意見が出てくるでしょう。 というか改めて思いますけど、内部標準って「ほら、なんでもかんでもではないですよ」と「ほら、同じだけ流していますよ」っていう結果でしか無いですよね。残念ながら私の場合、無意識に「じゃ細胞は元気なんだな」って考えがちですけど、論文をきちんと読める人はここで「とは言っても実は細胞死んでんじゃないの？」とか、すかさず突っ込めるのでしょうが、、、

(無題) 削除/引用 No.1548-9 - 2009/11/12 (木) 17:03:24 - ふと ねうろんさま そういうのっていったいどう判断するのでしょうかね。。。 なんか自分の都合のいい内部標準だけをだしたんじゃないの？って論文あるような。。。

(無題) 削除/引用 No.1548-8 - 2009/11/12 (木) 17:01:29 - ふと mom-aさま 他の実験でサポートするというのは、よくわかりますし、私ももちろんそうします。 しかし、こんな経験ないでしょうか？ 顕微鏡で見ると死んでいる細胞がいるにもかかわらず、MTTアッセイではそこそこ値が伸びているってこと。 これ結構あるんです。おそらくは細胞が薬剤によって死ぬ前に少しずつ増えていて それからちょっとずつ死んでいるからだと思ったりしてます（つっこまれても説明はあまりしたことないので） にゃふぅさま 薬剤を かけた細胞　ある遺伝子→低下 かけていない細胞　ある遺伝子→低下しない ウエスタンをすると アクチンの発現は変化なし でも、死んだ細胞がいる 死んだ細胞だけのウエスタンでもアクチンのバンドはきちんと確認できると知っている ある遺伝子が低下しているのは「それって、死んでいる細胞が混じっているからじゃないの？」 質問の書き直しは伝わっている方がいらっしゃるので良いのではないかと。 中年様 その通りでございます。 mRNAでなくてタンパク質ですが。 細かくタイムコースを取るのはおっしゃる通りであると思います。 しかし、細かくとってもはっきりしないときがあったりするのですよね。 私の実験結果ではなくミーティングでの話ですが。。。

(無題) 削除/引用 No.1548-7 - 2009/11/12 (木) 16:43:47 - 中年 トピ主ご本人の説明を待つべきところ横レスにて失礼します。 トピ主さんの仰るのは、アクチンやヒストンは安定なタンパク質であるので、死細胞（mRNAなどは分解が始まっている）の中でも結構そのままで残存していて、この量でノーマライズしてしまうと、死細胞の割合が多いほど不安定なmRNAのレベルは低く見積もられることになるのでは、ということだと思います。 その可能性は大いにあると思います。そう言う状況ならもっと細かくタイムコースを取ってみたいところです。

(無題) 削除/引用 No.1548-6 - 2009/11/12 (木) 16:12:01 - にゃふぅ 細胞染色とか個々の細胞を観察した実験を付け加えれば問題ないんじゃない？？ それよりも質問のほうが問題・・・ 「死んだ細胞を集めてアクチンとヒストンのwestern blotして分解産物らしきもの無しで検出できる」として「それって、死んでいる細胞が混じっているからじゃないの？」って結論にいたる思考経路がまったくわからん。 「死んだ細胞を集めてアクチンとヒストンのwestern blotして分解産物らしきもの無しで検出できない」もしくは「死んだ細胞を集めてアクチンとヒストンのwestern blotをすると生細胞よりも発現量が低下している」なら「それって、死んでいる細胞が混じっているからじゃないの？」って結論が理解できる。 私が言いたいことに心当たりがない方は無理に答えてくれなくてもいいのですという前に、もう一度きちんと質問しなおしては？？ ちなみにふとさんは何が何でもアクチン、ヒストンで比較することに疑問をもっていて、じゃぁどうしたらいいと思っているのか後学のために教えてもらえると助かります。

(無題) 削除/引用 No.1548-5 - 2009/11/12 (木) 16:10:02 - ねうろん 今、ちょうどそんな感じの、薬剤処理した細胞のWBの結果を眺めています。 サンプル処理前に観察した所、コントロールと比較して、みるからに細胞の調子がおかしかったものです。 （トリパンで染めてないですけど） んで今回のそのサンプルでは Tubulinー変化無し Actinー50%減少 GAPDHー80%減少 他の検出したタンパク質達は変化無しから激減と様々と。 で、だからどうした？ と言われると困るのですが。 まぁさてどうしたものかと考え中です。

遺伝子の発現に限らず 削除/引用 No.1548-4 - 2009/11/12 (木) 15:59:49 - mom-a 反応や活性やが低下している場合には「細胞が死んでいるのでは」ということは常に問題になるのではないかと思いますが。 MTTアッセイなどのデータを付けろとか言われる気がします。MTTで良いかどうか、というのは別の話として、何らかの確認が必要かと。 …という主旨でしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1548-3 - 2009/11/12 (木) 15:31:15 - ふと それは意味ないです。 そうではなくて、ある薬剤をかけて死にそうな時間帯にサンプルにしてたり・・・ 私が言いたいことに心当たりがない方は無理に答えてくれなくてもいいのです・・・ すみません。

(無題) 削除/引用 No.1548-2 - 2009/11/12 (木) 14:01:44 - おお 細胞が死んだ状態で遺伝子の発現の変化があるの、、、 死んだ状態で遺伝子の発現変化のいみあるの

何が何でもアクチン、ヒストンで比較 削除/引用 No.1548-1 - 2009/11/12 (木) 13:34:32 - ふと よく、細胞にある薬剤をかけたときに ある遺伝子の発現が落ちるとかありますよね。 また余談なんですが、私はとりあえず死んだ細胞がほぼ100％（トリパンブルーが真っ青） の細胞を集めて、ウエスタンして、アクチンとヒストンをやってみたことがあるんですけど、 バンド、ちゃんと出ちゃうんですよね、これ。しかも分解産物らしきもの無しで。 なので、ある薬物をかけた細胞と、かけていない細胞をウエスタンで比較して かけた細胞　ある遺伝子→低下 かけていない細胞　ある遺伝子→低下しない これを、アクチンとかヒストンとかはちゃんと同じ量だから大丈夫だっていうのに ちょっと疑問があったりするのですよ。（いや、自分でもそうやっているけど） 逆に、 かけた細胞　ある遺伝子→増加 かけていない細胞　ある遺伝子→変化無し とかだったらいいんですが、発現量が減るものにはちょっと 「それって、死んでいる細胞が混じっているからじゃないの？」って思うのですよね。 そんなのに限って、FACSとかで結構死んだ細胞がいる時間帯の細胞をサンプルにしてたりするんですよね。それか、その前の時間帯とか（たぶん死んだ細胞いるだろう時間ではあるような） まぁ、余談なんですけど、どうなんですかね。

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