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(無題) 削除/引用 No.1546-10 - 2009/11/17 (火) 21:40:48 - jazzmessenger 有益な情報ありがとございました。

(無題) 削除/引用 No.1546-9 - 2009/11/13 (金) 03:32:03 - おお >[Re:6] jazzmessengerさんは書きました : > お二人が指摘されたとおり、SNPですのでどこまで差がでるのか心配でした。しかし、あるSNPのCとAアレルでルシフェラーゼ活性に10倍の差がみれました。適切なコントロールを使って、再現性を確かめないといけませんが。 いい結果が出てるようですね。

(無題) 削除/引用 No.1546-8 - 2009/11/13 (金) 01:09:20 - おお プロメガがルシフェラーゼに関しては、商品を幅広く とりそろえています。自作しなくても買えると思います。

(無題) 削除/引用 No.1546-7 - 2009/11/13 (金) 00:56:38 - \ こんにちは。 以前プロメガのpGL3シリーズを使っていました。 使い勝手は良かったですね。ちょっと高価な気もしますが。 今は、pGL4に置き換わっているようで。 http://www.promega.co.jp/cat/1002001.html プロモーター領域のSNP1個でも活性が結構変わりうるという のはよくある話だと思います。ポジティブな結果が出ると 良いですね。

ありがとうございました 削除/引用 No.1546-6 - 2009/11/12 (木) 22:59:22 - jazzmessenger おお様、〜様、 早速レスありがとうございました。やはり何かしら補正が必要ということですね。 ダブルルシフェラーゼベクターなるものは知りませんでした。確かにこれを使用するとコピー数など、補正できるのが納得できます。まったく別のベクターを同時にトランスフェクションすることで、どこまでコントロールできるのか疑問視していました。今回の質問にいたった経緯です。ところでそのようなベクターは市販されいるのでしょうか。それとも自作でしょうか。 お二人が指摘されたとおり、SNPですのでどこまで差がでるのか心配でした。しかし、あるSNPのCとAアレルでルシフェラーゼ活性に10倍の差がみれました。適切なコントロールを使って、再現性を確かめないといけませんが。

(無題) 削除/引用 No.1546-5 - 2009/11/12 (木) 22:41:44 - jazzmessenger >[Re:3] ：さんは書きました : > まず、あなたの上司は何と言っているのか聞きたいものです。 私が指示を出す立場なのですが、ルシフェラーゼアッセイは初めてです。自分なりに調べた上で、どのコントロールが適切か疑問だったので質問させてもらいました。

(無題) 削除/引用 No.1546-4 - 2009/11/12 (木) 13:55:27 - ~ 私は同じベクター中にSV40プロモーター付きのレニラのルシフェラーゼも入ったダブルルシフェラーゼベクターを使っていました。ファイアフライとレニラのコピー数が同じになるので、それで補正できます。 その様なベクターが出る前は、ラボとしてはセルライセートを分けて、ルシフェラーゼ活性測定とたんぱく質量測定をし、タンパク質量で補正していました。 貴方の場合、そのSNPがどの位クリティカルな塩基なのか分かりませんが、 ダブルルシフェラーゼアッセイでも難しいような気がします。 ただ、既にベクターが出来ているのですから、ベクターの乗せ変え、適当なコントロールベクターとのコトランスフェクションなどを考える前に、まずはDNA量でそろえて5連くらいで見てみてはいかがでしょうか。 （ウェルが余るでしょうから希釈系列などもつけて） 明らかな差が見られていれば、適当なコントロールを探せばいいでしょうし、 違いが微妙であればルシフェラーゼアッセイで見るかどうか自体を検討することになるでしょう。ルシフェラーゼアッセイでは難しそうだというのがコントロール用ベクターを買ったり、ベクターを作り直したりする前に分かれば、これまでの作業が少しは報われると思います。

(無題) 削除/引用 No.1546-3 - 2009/11/12 (木) 13:14:41 - ： まず、あなたの上司は何と言っているのか聞きたいものです。

(無題) 削除/引用 No.1546-2 - 2009/11/12 (木) 13:01:35 - おお >[Re:1] jazzmessengerさんは書きました : > そこで質問なのですが、このアッセイにはどのようなコントロールを使用されていますか。トランスフェクションのコントロールとして、ルシフェラーゼ以外の蛍光ベクターを一緒に入れることがあるようですが、ルシフェラーゼ/コントロール値を出すということでしょうか。DNA量を一定にさえすれば、同じDNAのウェル間でそんなに差が出るようにも思えないのですが。 意外とぶれるもんです。うで、トランスフェクションの方法にもよるでしょうけど、、、 ウミシイタケルシフェラーゼをSV40などのプロモーターの 下流につないだインターナルコントロールを使い補正したり します。 むかしはLacZとかつかってましたけど。 プロメガとか解説してないかなぁ、、、 でもSNPsのですよね、、、微妙な差になるかもしれない し、、、そうなると信用できるデーターになるかなぁ、、、、

ルシフェラーゼのコントロール 削除/引用 No.1546-1 - 2009/11/12 (木) 12:38:52 - jazzmessenger 最近ルシフェラーゼアッセイを始めた者です。目的はプロモータにあるSNPの解析です。遺伝子上流２Kbをルシフェラーゼベクターに入れたもので、SNPの二つのアレルを比較しています。 そこで質問なのですが、このアッセイにはどのようなコントロールを使用されていますか。トランスフェクションのコントロールとして、ルシフェラーゼ以外の蛍光ベクターを一緒に入れることがあるようですが、ルシフェラーゼ/コントロール値を出すということでしょうか。DNA量を一定にさえすれば、同じDNAのウェル間でそんなに差が出るようにも思えないのですが。 経験のある方、よろしくお願い致します。

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