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(無題) 削除/引用 No.1542-10 - 2009/12/15 (火) 05:29:17 - ひぶー mouseさんへ いろいろご指摘ありがとうございました。死細胞を除いてから解析してみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.1542-9 - 2009/12/13 (日) 17:31:37 - mouse FACSで解析したいだけであれば、percoll遠心なしで直接FACSに行った方が 結果的にloss少なく解析できるかもしれませんね。ヒトの腸管LPMCでやる際は、FSC/SSCで厳しめにゲートし、PI等で死細胞をゲートアウトすれば大丈夫です。その後CD3とCD4でリンパ球を同定して解析しています。 マウスでもヒトでもPI等で死細胞を除去しないと解析に耐えられないですね。

(無題) 削除/引用 No.1542-8 - 2009/12/12 (土) 23:14:20 - ひぶー mouseさんへ そうですか。やはりviabilityは良くないですよね。死細胞が多いためかFACSで4colorを見る場合、compensationがうまくいかないのですが(もちろん染色する抗体にもよると思いますが)、死細胞の割合を少なくするために何か工夫されていることがあれば教えてください(例えば、Percoll遠心を2回行うなど)。

(無題) 削除/引用 No.1542-7 - 2009/12/12 (土) 03:54:09 - mouse 一匹当たりの収量は0.5-1.0ｘ106くらいで、FACSのゲ-ティングを見る限りは lymphocyteは10-30％くらいviableでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.1542-6 - 2009/12/09 (水) 01:02:28 - ひぶー mouseさんへ さっそっくの返事ありがとうございます。われわれもお示し頂いたNature ProtocolのPaperに忠実に従って採集を試みておりまして、20分で3-4回消化しています。細胞数は十分とれるようになったのですが、半分以上が死んでいます。なにが原因でしょうか？気になる点は40μmのフィルターに通りにくいこととVortexの程度が強すぎることを考えていますが、mouseさんは死細胞は何%程度存在しますか？

(無題) 削除/引用 No.1542-5 - 2009/12/08 (火) 04:11:17 - mouse 20分を一回だけでは取り損ねてるLPMCがあるので、mediumがキレイになるまで数回繰り返してみるのがいいのではないでしょうか？ 私は15-20分を2-3回しています。 またその後のパーコール遠心でもロスすることが多いですね。 http://www.nature.com/nprot/journal/v2/n10/full/nprot.2007.315.html

(無題) 削除/引用 No.1542-4 - 2009/12/06 (日) 23:47:47 - ひぶー mouseさんへ 追記です。1匹あたりのwhole lymphocyte数は0.5ミリオンです。しかし半分以上が死んでいます。

(無題) 削除/引用 No.1542-3 - 2009/12/06 (日) 23:24:01 - ひぶー mouseさんへ 返事がおそくなりました。Collagenase D 0.05g/100ml、DNase 0.05g/100ml、Dispase 0.3g/100mlで、incubation timeは20minです。(15minとしてもダメでした。)

(無題) 削除/引用 No.1542-2 - 2009/11/13 (金) 06:01:57 - mouse incubate時間や、Collagenase濃度等はどの程度でしょうか？ また1匹あたりのmouseの収量は？

マウス小腸lamina propria lymphocyte採集 削除/引用 No.1542-1 - 2009/11/11 (水) 20:33:41 - ひぶー マウスのLPL採集を試みています。EDTA入りのsolutionでincubateしIELや上皮細胞を除去したのち、Collagenase D、Dispase、DNaseで1mm片にした小腸を消化しPacol gradientで採集しています。しかし死細胞が多く、また収量も多くありません。消化後に100μmのフィルターを通す際に目詰まりするのが、収量低下の原因になっていると思っているのですが、同じような実験をした方がいらっしゃれば、コツをご教示いただきたいのですが。

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