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(無題) 削除/引用 No.1540-16 - 2009/12/02 (水) 13:28:53 - neprilysin+実験 アドバイスありがとうございます。 今回用いているYFPベクターに関してはカナマイシン耐性ということで、ほかの実験から確認していますので問題ないと思います 現在の状況について詳しくご説明させていただきます 一つの断片は、Hind3とAfl�U、もう一つの断片については、Afl�UとBamH�TをもちいてTOPOベクターから切断しています。その後、YFPN-1ベクターを、Hind�VとBamH�Tを用いて切断し、開いた部分に、上記の二つの断片をライゲーションしようとしています。 現在の段階においては、2つの断片同時に行うことを考えて行っていますが、同時にアドバイスにもありますように、まず、上記の2つの断片を一つにして、その後YFPに入れることも行っています。 現在は、コロニーができましたのでインサートチェックを行っています。

(無題) 削除/引用 No.1540-15 - 2009/12/01 (火) 20:36:35 - やま Hid3-Bgl2とBgl2-Afl2の二つのインサートを ベクターのHid3　Afl2サイトに入れるように変更したという事でしょうか？ まさかと思いますが回復培養はやってますよね？ （Ampで回復培養なしのプロトコルを使っている人はKmのときに 回復培養を忘れがちなので） 私や他の方の回答にもありますが、一個ずつやる方法や インサートのみをライゲーションしてからベクターに入れる方法などは 試す予定はないのでしょうか？ もうちょっと工程を詳しく書いた方が良いのではないかと思いますが。 実際に上手くできている先輩などは周りにいないでしょうか？ できたらやっているところを見せてもらって自分との違いを観察する のが一番だと思うのですが。

(無題) 削除/引用 No.1540-14 - 2009/12/01 (火) 16:28:26 - ~ コントロールを置いて、作業に問題が無いと確認できている操作はないのですか？ >抗生物質はカナマイシンを用いていますので、そこの問題はないと思います。 YFPベクターというのは特定の１製品を意味していないでしょう。 例えばクロンテック製品であれば、YFPを含むベクターにはアンピシリン耐性のものとカナマイシン耐性のものがありますよね。 親株をトランスフォーメーションして撒いておけば、大腸菌のタイターやプレートに問題が無いことも確認できるでしょう。 （トラブルが生じていなければそこまでする必要は無いですが） >制限酵素でとってくるものはきちんととれていると考えますが。 全ての工程に問題が無ければ取れるのでしょう。 そのため、きちんと取れていると考える根拠が無いのであれば、疑うべきだと思います。 切り出し時にUVをあてるのを止めたら取れるようになったという人もいます。 切り出して精製して、泳動したらバンドが見えたというのは、きちんと取れていることを裏付けるには弱いデータだと思います。

たくさんのアドバイスありがとうございます 削除/引用 No.1540-13 - 2009/11/30 (月) 18:28:09 - neprilysin実験 いろいろたくさんのアドバイスありがとうございました。 コンパチブル末端が原因ではないかという指摘を受けまして、制限酵素をAfl�Uに変更しまして現在行っています。 しかしながら、今回はYFPベクターにライゲーションしたのち、形質転換しLBプレートにまきオーバーないとしましたが、コロニーが出来ない状態です。 抗生物質はカナマイシンを用いていますので、そこの問題はないと思います。 また、制限酵素でとってくるものはきちんととれていると考えますが。

(無題) 削除/引用 No.1540-12 - 2009/11/14 (土) 11:34:29 - おお >[Re:11] おおさんは書きました : > vector-HinDIII-BglII--BamHI-BglII-vector > ライゲーション後BglII and/or BamHIカットしてトランスフォーメーションかなぁそれでもHindIII-BglII断片だけ入ったクローンは除けないから、、、ちょっとくるしいか。 まてよHindIII-BglIIのBglII末端と、ベクターのBamHI末端を脱燐酸化しとけば ましか。

(無題) 削除/引用 No.1540-11 - 2009/11/14 (土) 11:31:48 - おお vector-HinDIII-BglII--BglII-BamHI-vector で入れる予定ならBamHIをブラントにした方がらくかも vector-HinDIII-BglII--BamHI-BglII-vector ライゲーション後BglII and/or BamHIカットしてトランスフォーメーションかなぁそれでもHindIII-BglII断片だけ入ったクローンは除けないから、、、ちょっとくるしいか。

(無題) 削除/引用 No.1540-10 - 2009/11/14 (土) 10:21:56 - おお あー3ピースなのね、、、、たしかにちょっと難しそうですね。 クローニングベクターでマルチクローニングサイトがうまく利用できそうな ものに一つずつインサートしたりしてワンステップかましてた方が いいかもよ。こういうのはできそうだからついつい何回もトライしちゃったり する事もあるけど、それで泥沼にはまることもあるし。

(無題) 削除/引用 No.1540-9 - 2009/11/14 (土) 10:02:20 - やま 二つの断片を同時に１つのベクターに入れようとしているのですよね？ 当たり前ですが１つの断片をベクターに入れるより難易度は上がります。 一方がBgl�UとBamH�Tなので目的の物がとれる確率は更に下がりますし。 二つの断片の濃度はきちんとそろえていますか？ 一番簡単なのは日数が増えてしまいますが 断片を他のベクターから切り出しているのでいたら 最初にもう一方の断片をそのベクターに入れて繋がった１つの断片を作り、 それを切り出して目的のベクターに入れるという二段階の方式の方が 確実で良いと思います。 もちろん一発でできる方が良いですが、何日もできなくて日を無駄にするより 実際には早くできると思います。 もしインサートがPCR産物なら、断片同士をライゲーションした後に 両端のプライマーでPCRしてから入れれば確実だと思います。

(無題) 削除/引用 No.1540-8 - 2009/11/12 (木) 12:04:24 - う 身近な先輩，先生に聞いた方が利口だと思います。

(無題) 削除/引用 No.1540-7 - 2009/11/12 (木) 05:06:06 - おお >[Re:1] neprilysin 実験さんは書きました : > 現在ベクター（bamh1 hind�V）にてマルチクローニングサイトを切断し、その後、2つの断片（一つ目はHind�VとBgl�U、2つ目はBgl�Uとbamh�Tにて切断）を用いライゲーションを行っていますが、 Bgl�Uとbamh�Tできって、ベクターのbamh1 hind�Vに挿入してるのでしょうか????

(無題) 削除/引用 No.1540-6 - 2009/11/12 (木) 05:03:54 - おお >[Re:1] neprilysin 実験さんは書きました : > うまくいかれた例などあれば教えてください。 たいていうまくいってます。 やった過程と結果(状況)が把握できませんので、 いまいちチャンとアドバイスできません。 コンピの効率はどうでしょうか?

(無題) 削除/引用 No.1540-5 - 2009/11/11 (水) 19:19:32 - ~ >うまくいかれた例などあれば教えてください。 貴方がうまくいかない原因を突き止めるか、原因はともかく実験を進められるようにクローンを得ることがこの質問の目的であり、 うまくいった組み合わせなどを言っても貴方の問題は解決しないのではないでしょうか。 >制限酵素の失活などは考えられず、きちんと断片は得られています。 とりあえず制限酵素が失活していないことは確認できていますね。 他に何が問題ないことが確認できているのですか？ １．リガーゼの活性 ２．DNA断片の濃度と純度 ３．トランスフォーメーションのタイター ４．選択用のプレート などはトラブルが起きているのであれば見ておいたほうがいいでしょう。 また、測定がなかなか出来ずにプロセスが適当であるかで判断する点として、 １．DNA断片のUVによる傷 があります。

(無題) 削除/引用 No.1540-4 - 2009/11/11 (水) 18:52:19 - AP 一口にうまくいかないといっても、実際どういうところがうまくいかないのでしょうか。コロニーが出てこない、あるいは極端に少ないのか、コロニーは出てくるけれど空なのか、空ではないけれど目的の構造のものがとれないのか、、、 ライゲーションがうまくいかないという場合、実際にはライゲーション反応は進んでいるけれど（おっしゃるとおり、ライゲースの失活とかその他の理由でライゲーション反応が起こっていないということは、まずないです）、コロニーが出てこないということがほとんどです。さらに言うと、しばしばある原因は、切り出しのときのUV被爆によってチミンダイマーが生じたため、ちゃんとできたライゲーション産物でも大腸菌の中で複製不能となることです。 すでに指摘がありますがBamHIとBglIIはコンパチブル末端でライゲーションが起こります。わかった上であえてやっているのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.1540-3 - 2009/11/11 (水) 18:49:52 - ats これらの二種類の断片が組み込まれるパターンは三種あるので、liagtionがうまくいっても目的産物を得るにはそれなりのクローン数を調べる必要がありそうです。 Hind�V-Bgl�U-BamH�Tとligationされたものがほしいなら以下の方法が良いと思います。 (1)多めの2つの断片、Hind�V-Bgl�U、Bgl�U-BamH�Tをligationして、精製します。 (2)そのligation産物をHindIII+BamHIで切断し、目的サイズのバンドをゲルから切り出します。 (3)これをvectorとligationします。

(無題) 削除/引用 No.1540-2 - 2009/11/11 (水) 18:37:31 - ats まず、vectorに二つの断片を同時に組み込むことが目的ですよね？ また、どのようにうまくいかない＝どのような産物が取れるのでしょうか。 Bgl2部位はBamH1部位とligation可能であるので、うまくいかない理由は沢山考えられます。

ライゲーションがうまくいかない 削除/引用 No.1540-1 - 2009/11/11 (水) 18:28:02 - neprilysin 実験 現在ベクター（bamh1 hind�V）にてマルチクローニングサイトを切断し、その後、2つの断片（一つ目はHind�VとBgl�U、2つ目はBgl�Uとbamh�Tにて切断）を用いライゲーションを行っていますが、なぜかうまくいきません。 制限酵素の失活などは考えられず、きちんと断片は得られています。 ライゲーション時にはT4りガーゼとバッファーを用いています。 基本的にはまぜて16度にてオーバーナイト行っています。 うまくいかれた例などあれば教えてください。

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