BioTechnicalフォーラム [GFPタグタンパクによる局在の信用せい]

(無題)

No.1535-15 - 2009/11/13 (金) 02:56:32 - おお

>[Re:13] cさんは書きました :
> GFPとかGSTとか蛋白質性タグのなかになにかシグナル配列とか修飾のコンセンサス配列（候補）のようなアミノ酸配列とか隠れてないでしょうか。ある程度の大きさを持つ蛋白質ですから、インフォーマティクスとかでそうした解析の専門の方がじっくり調べたら何か見つかりそうな気がするのですが。GFPやタグ付きリコンビナントを主要な研究ツールとしている方には意地悪に思われる研究かもしれないですが、GFPなどタグリコンビナントの実験に潜在する注意すべきアーティファクトの原因の一部が分かるかもしれないし。

それに近いことで気になっているのですが、GFPをマンマルのcDNAにあてて
Y2Hスクリーニングするとなにかつれるだろうかなんて思ってここに
投げたことはありますが、、、、、
まあそんなことはふつうやらないですしね、、、
マスでGFPタグの目的のタンパクとGFPだけで比較したようなデーターを
みればもしかしたらGFPにしんわせいがあるタンパクとか可能せい
を考えられるかもしれませんね。

(無題)

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No.1535-13 - 2009/11/12 (木) 20:55:03 - c

GFPとかGSTとか蛋白質性タグのなかになにかシグナル配列とか修飾のコンセンサス配列（候補）のようなアミノ酸配列とか隠れてないでしょうか。ある程度の大きさを持つ蛋白質ですから、インフォーマティクスとかでそうした解析の専門の方がじっくり調べたら何か見つかりそうな気がするのですが。GFPやタグ付きリコンビナントを主要な研究ツールとしている方には意地悪に思われる研究かもしれないですが、GFPなどタグリコンビナントの実験に潜在する注意すべきアーティファクトの原因の一部が分かるかもしれないし。

(無題)

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No.1535-12 - 2009/11/12 (木) 05:37:41 - おお

>[Re:5] ：さんは書きました :

> どんなタグであれ、危険性があるということを念頭に置いて
> 実験に使うものでしょ？

それに基づいてあなたの経験などをおききしたいとおもいます。
タグとエンドのものを比べてどのように違ったとか、
それがどういう理由だったかとか、、、、

(無題)

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No.1535-11 - 2009/11/12 (木) 05:34:37 - おお

>[Re:8] 12さんは書きました :
> そうでなくてたとえばＣ末のほんの短い部分がトリムされた、等ということを知る一般的な方法はなく、なかなか難題です。ただ、そういう場合、大抵、blottingやパルスチェイスをやれば短いバンドがでてくるので、それで判定できることもあります。それによって局在が変わる可能性はもちろんあるわけで。場所を見るだけなら、タグをつけないでできれば内在性のを、だめならタグ無しのものを少量発現して染めた方が無難です、という当たり前の結論しか思いつかないです。

ありがとうございます。

そういえばスペシフィックな抗体で内在性のものを染めても
分解という意味では同じ問題がつきまといますよね。

N末とC末の抗体で局在が違うようにみえるとか、、、

(無題)

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No.1535-10 - 2009/11/12 (木) 04:01:53 - おお

>[Re:2] ｙｔさんは書きました :

>
> GFPが二量体、蛍光蛋白によっては四量体などを作り安いと言うのもよく知られていることですし、この手の実験は額面通りに受け取るのは危険だという印象を持っています。もちろん、使い方さえしっかしすれば有用なツールであることは異論はありません。

ありがとうございます。

GFPなどは多量体をつくるということで、作らないあるいは作りにくい
変異体とか、ほかの蛍光たんぱく質が随分前から出回ってますね。

こういう蛍光たんぱく質のくせ見たいなので経験上気がついたことが
ある方があればどなたか発現していただけると嬉しいです。

(無題)

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No.1535-9 - 2009/11/12 (木) 03:22:31 - おお

>[Re:5] ：さんは書きました :
> 何を今更と思いました。
>
> どんなタグであれ、危険性があるということを念頭に置いて
> 実験に使うものでしょ？
>
> そんなこと常識かと思います。

常識だと思います。
たとえば出回っている論文、発表その過程を
示してないものも結構あるみたいで、表面状
その常識すら考慮に入れていないように見える
こともあるわけです。
おそらく考慮していてもそこは論文の趣旨と
直接関係ないのであまり示さないのか、
考慮して、納得の行くデーターだけを示している
けどそれ以外のことを言及していないのか、、

ではその常識のためのみなさんのアプローチ
や経験など、聞きたいと思っているわけです。
例えば5%が分解産物でその分解
産物の局在が興味ある場所の局在である可能性とか
疑ったり疑われたりしたときはどうでしょうか?

そういうのを含めて議論ができればいいとおもいます。

(無題)

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No.1535-8 - 2009/11/12 (木) 02:32:41 - 12

おおさんのしつもんは、GFP fusionとした場合、ものだけが壊れてＧＦＰが残る場合があるかということですよね。これは壊れるということの意味にもより、バラバラになるという意味であれば、たぶんこの場合はプロテアソーム経由なので、これはGFPも一緒に壊されることが大部分と思いますというか、私の経験ではＧＦＰだけ残ったということはありません。ただ、ものにニックが入ることはよくあり、これがやっかいです。もしそれが膜結合部分を切り離すようなsheddingであれば、それは、FRAPやFCSや１分子などで動きを測れば大体わかります。そうでなくてたとえばＣ末のほんの短い部分がトリムされた、等ということを知る一般的な方法はなく、なかなか難題です。ただ、そういう場合、大抵、blottingやパルスチェイスをやれば短いバンドがでてくるので、それで判定できることもあります。それによって局在が変わる可能性はもちろんあるわけで。場所を見るだけなら、タグをつけないでできれば内在性のを、だめならタグ無しのものを少量発現して染めた方が無難です、という当たり前の結論しか思いつかないです。

(無題)

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No.1535-7 - 2009/11/12 (木) 00:23:19 - ｙｔ

今のところ「局在」についての意見が多いようですが、GFPや他の蛍光蛋白或いは他の蛍光タグの利点というのは「生細胞内での目的蛋白の挙動を観察できる」という点にあると思います。
と言うか、局在を見たいだけなのであれば、固定細胞で免疫染色をすればよいだけであって、わざわざ蛍光蛋白を使う必要が無いと思います。もっとも、免疫染色が難しいとか良い抗体が無いという場合は別ですが。
　
ただ、あくまでも生細胞にこだわる場合、今眼下にある「その蛍光を発しているもの」が本当に目的とする蛋白なのか？それとも分解された後の蛍光蛋白なのか？その場で判断する術がありません。これは大きな視野で見るならまだしも、細胞のごく一部に分布する少数の分子とか究極的には単分子観察とかの場合に特に問題になってくると思います。
おお　さんの質問もそういうところから来たのではないか？という気がします。

(無題)

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No.1535-6 - 2009/11/11 (水) 21:27:28 - c

私は蛍光抗体法などで内在性のものの局在をみる実験をしてみて、それがどうしても難しいとき次の選択としてやむおえずタグ付き蛋白質でやってみる、という感じです。多くの人が言うように、GFP-蛋白質をはじめタグ付き蛋白質でみる局在が本来のその局在と一致しているのかどうかは分かりませんし、実際違うことがあるような話も聞いたことがあります。だからGFPしか局在のデータが得られないときは、厳密にはそうした可能性は否定出来ないと一言書くか、細胞分画など他の方法で内在性のものの局在を調べて、それとGFPのデータが一致することをしめすなどのサポートデータを加えるかするというやり方で対処できるとおもいます。

(無題)

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No.1535-4 - 2009/11/11 (水) 16:28:20 - 直接の抗体

タグとしては大きいので、立体障害などの間接的な要因で、間違ったデータが得られる可能性があります。

やはり、直接の抗体を用いたり、HAタグなどの短いタグを用いるのが第一の選択肢になると思います。（バックグラウンドが低くなければなりません）生きた細胞でダイナミックに追跡したいというのでなければ。

(無題)

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No.1535-3 - 2009/11/11 (水) 16:08:13 - A1

局在がメインの論文でなければ、GFP融合タンパク質の局在を見るだけでいいが、局在がその論文で重要となる場合には、間接蛍光抗体法などと組み合わせないとアクセプトされないと以前聞いた気がします。もちろん、雑誌によると思いますが。

(無題)

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No.1535-2 - 2009/11/11 (水) 14:48:21 - ｙｔ

自分の実験では別の種類の蛍光標識を専ら使っていて、あまりGFP標識を使うことはないのですが、この手の実験一般に内在する問題だと思います。

だから、目的とする蛋白がどういう代謝・分解を受けるか、どの程度の半減期なのか、分解されて蛍光標識のみになってしまったものがどの程度の割合で存在するかなどを把握した上で解釈する必要があって苦労しています。

それと、私は膜蛋白をあつかっているのですが、GFP標識したものは発現量が多くなる傾向があるように思います。同時に細胞表面の蛍光も高くなる気がするので、もしかしたら蛍光蛋白標識によって蛋白の挙動が変わった（細胞表面に滞留する時間が長くなった）ために、半減期が長くなっているのではないかと思っています。つまり、「目的蛋白の局在に影響している」　一例のようなものも経験しています。

GFPが二量体、蛍光蛋白によっては四量体などを作り安いと言うのもよく知られていることですし、この手の実験は額面通りに受け取るのは危険だという印象を持っています。もちろん、使い方さえしっかしすれば有用なツールであることは異論はありません。

GFPタグタンパクによる局在の信用せい

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No.1535-1 - 2009/11/11 (水) 03:41:12 - おお

GFPタグタンパクなど蛍光たんぱく質をタグとして使い局在などを調べる
実験は一般的に使われるようになってきました。

かなりの人が一度は使ったことがあるのではと思いますので
みなさんの経験とか共有できればとおもいます。

GFPは比較的大きく場合によっては生理的なタンパク相互作用
を妨げたりして、それが局在に影響する可能性は否定できない
のは想像できます。

一方GFPは比較的安定なタンパクです。タグを入れたタンパク
が分解していてもGFPはもしかしたら安定に細胞内に残ってるかもしれません。
この場合はGFPのシグナルはターゲットのタンパクの局在は
反映いたしません。比較的たくさんのインタクトなGFPを
持つ分解産物がある時はウエスタン出来がつくと思いますが、
もしそうでなかったら、、、

このようなことに関して、みなさんの考えや経験をおきかせください。
GFPに限らずほかのタグに関するインフォメーションでも
結構です。