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(無題) 削除/引用 No.1521-10 - 2009/11/10 (火) 17:45:55 - yutaka 残留エタノール、塩等の不純物が悪さをしているようですね。 取りあえずサンプルを希釈して再度シークエンサーにかけたところ そこそこ読めるようになりました。 ＜プロトコル＞ sQで2倍希釈 シークエンサー or Hi-Diで2倍希釈 95℃, 2min on ice, 5min シークエンサー 中年様、おお様、ザンギ様 大変有益なコメントどうもありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.1521-9 - 2009/11/10 (火) 02:15:21 - おお >[Re:8] ザンギさんは書きました : > エタ沈のときに塩が除けてないんじゃないかなぁと思いますが。 アルコールが除けてないかも、、、、、 なんがしかのりゆうでえいどうが乱れているような きがします

(無題) 削除/引用 No.1521-8 - 2009/11/10 (火) 01:47:29 - ザンギ エタ沈のときに塩が除けてないんじゃないかなぁと思いますが。

(無題) 削除/引用 No.1521-7 - 2009/11/10 (火) 01:28:44 - おお キャピラリーのつまりか、ゲルの劣化とか ゲル充てんの具合がわるいとかではないでしょうか、、、 キャピラリーにあったゲルを使ってますかね、、、、 たしかサイズによって違いましたよね、、、、、 あとバッファーかなぁ、、、えいどうに影響をあたえるのは、、、 一応波形は出ているわけですよね。

(無題) 削除/引用 No.1521-6 - 2009/11/09 (月) 22:30:07 - 中年 うーん、ステップの多い作業なので、これだけの情報ではどこが問題だかは私には分かりません。順を追ってチェックするしかないのでは？他の人は同じ機械、同じセッティングで上手く行ってるんですよね。だとすると、シークエンス反応が問題だということになります。 思いつくのは、プラスミドがきちんと取れていることを、ODだけではなく、一部をアガロースのミニゲルに泳動してチェックしてみる。エタ沈でロスる可能性があるので、ゲルろ過等、他の処理法を試してみる。最後の溶解はsQということになっていますが、これは正しいのですよね（私は3130xlは使ったことがありません）。

(無題) 削除/引用 No.1521-5 - 2009/11/09 (月) 21:55:06 - yutaka >[Re:4] 中年さんは書きました : > ファーストピークを自分で読み取って再解析すれば、プライマー近くは抜けていてもシーケンス自体は読めるのですか？それとも、どうやってもどこもシークエンスが読めていないのですか？ 中年様 ピークのクオリティが低いのでシークエンスは全く読めません。

(無題) 削除/引用 No.1521-4 - 2009/11/09 (月) 21:51:12 - 中年 ファーストピークを自分で読み取って再解析すれば、プライマー近くは抜けていてもシーケンス自体は読めるのですか？それとも、どうやってもどこもシークエンスが読めていないのですか？

訂正 削除/引用 No.1521-3 - 2009/11/09 (月) 20:45:35 - yutaka ×260/230 2.29-3.35 ○260/230 2.29-2.35 ×10 uL/wellのｓQに溶解 ○20 uL/wellのｓQに溶解

シークエンスの失敗（ファーストシグナルが遅い） 削除/引用 No.1521-1 - 2009/11/09 (月) 20:21:03 - yutaka プラスミドのシークエンスが全く読めずに困っています。 どなたか原因がわかる方アドバイスをいただければ幸いです。 症状としてはRawデータでシグナルが観測されるのが非常に遅く、かつワイドなピークです。 通常は2000〜3000スキャンの間にファーストピークが観測されるのですが、 失敗する場合は7000スキャン以降にファーストピークが観測されます。 シグナル強度は5000〜8000程度（読める場合は1000~8000程度）です。 ＜プロトコル＞ プラスミド長：約10kB 大腸菌培養 ↓ QIAprep Spin Miniprep kit でプラスミド回収 ↓ ナノドロップで定量 260/280 1.84~1.89 260/230 2.29~3.35 ↓ BigDye反応 10 uLスケール テンプレート量：200ng/well ↓ エタ沈 ↓ 10 uL/wellのｓQに溶解 ↓ 3130xlでシークエンス

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