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(無題) 削除/引用 No.1506-4 - 2009/11/07 (土) 00:38:17 - xxx APさんありがとうございます。 DNAの重合が起こっているということは、テンプレートの量が多いかサイクル数が多いということですね。 サイクル数25で行っていたのですが15、10と減らしていこうと思います。

(無題) 削除/引用 No.1506-3 - 2009/11/06 (金) 21:08:40 - AP >をかけるとPCRプロダクトによるバンドが得られずスメアのようになってしまいます。また、ウェルの部分が強く光っているのも不可解です。 これはどんなregimeのPCRであろうとよくある失敗で、DNAの重合が起こっているのでしょう。鋳型DNAに対して、プライマーがアニールしてそこから伸長が起こるのがPCRですが、鋳型となるPCR産物がある程度以上増えると、プライマーとアニールするよりも鋳型同士でアニールしやすくなります。一方のDNA鎖の3'末端が、他方のDNA鎖のどこか不正な位置にアニールすれば、そこから伸長がおこって、キメラになったより長い産物ができます。こういうことを繰り返すと、どんどん重合が起こっていきスメアになったり、ものすごく巨大なサイズのDNAを生じたりします。

2nd PCRでスメア 削除/引用 No.1506-1 - 2009/11/06 (金) 18:55:30 - xxx 自分で考えても理由がわからず、大変困っています。 お知恵をかして頂ければ幸いです。 　まず、ヒトゲノムDNAを2 step PCRにかけて290 bpのプロダクトを得ます。 これをゲルの切り出しにより、抽出・精製したものを同様にPCRし、同じく290 bpのPCRプロダクトを得ます。 　 　ここまではうまく行くのですが、このプロダクトをヌクレアーゼフリーウォーターで100倍、1000倍と希釈して2 step PCRをかけるとPCRプロダクトによるバンドが得られずスメアのようになってしまいます。また、ウェルの部分が強く光っているのも不可解です。 　どなたか原因に心当たりがあれば教えてください。

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