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(無題) 削除/引用 No.1502-7 - 2009/11/06 (金) 18:58:38 - あべちゃん 考えてみたけど思い浮かびません。レスがないので、妄想かもしれないですが・・・ wholeはソニックを十分当ててますが、N分画はキットの溶液を加えて遠心上清ですよね。 例えば、ソニックしている間にクロマチンに結合している転写因子がぽろぽろとはがれて、刺激なしの細胞でも見かけ上量が増える。 結果、元々総量の同じ転写因子が、クロマチンに多く結合している為、刺激なしのN画分C画分では少なく見えるが、ソニックしてクロマチンからほぼ全ての転写因子がはがれて、wholeでは同じになる。 やっぱくるしいですね。 でも、N画分を取った時のペレットがどうなっているかは気になります。

(無題) 削除/引用 No.1502-6 - 2009/11/06 (金) 14:15:41 - 関西人院生 追加です。 マウスマクロファージ（初代培養）の2x10^6を分画抽出し、N分画は40ug（濃度1.5ug/uL）程度、C分画は250ug（濃度2ug/uL)程度得られています。細胞は異なりますが、製品マニュアルの回収目安量とほぼ同じくらいです。N20ug、C50ugをSDS-PAGEにアプライしています。

(無題) 削除/引用 No.1502-5 - 2009/11/06 (金) 14:05:34 - 関西人院生 ありがとうございます。 whole cell lysate調整とIBについては以下の流れです。 RIPA（＋蛋白分解酵素阻害剤）で回収 →sonication（氷水中・30秒ON30秒OFFを6サイクル） →4℃20000rcfx20分で遠心 →上清採取（蛋白濃度約2mg/ml） →20ug相当にSDS sample bufferを加え95℃x5分間boil →SDS-PAGE→ウサギポリクロ抗体で検出（ノンスペバンド(-)） 今の所、RIPA（SDS0.1%)以外での回収は試みておりません・・・。 n=3で比較しており、コントロール（alpha-tubulinまたはnucleophosmin）を置いています。分画抽出後の蛋白濃度、さらにコントロールについても両群で差はなかったので、サンプル調整そのものはうまくいっていると考えています。

(無題) 削除/引用 No.1502-4 - 2009/11/06 (金) 13:49:45 - おお >[Re:3] うさんは書きました : > 難しく考える前に、皆が思うことに付いてもっと細かく条件とやったことを書かないと。 うさんの仰る通りだと思います。いろいろな問題が 考えられると思います。抽出時のロスとか確実性、 見積がタンパク量レベルなのかフラクションから 同じ量取ったのか、、、、 チェックポイントがいろいろありますので、まずは 差支えのない範囲で条件など詳しく書かれることを おすすめいたします。

(無題) 削除/引用 No.1502-3 - 2009/11/06 (金) 13:18:10 - う 難しく考える前に、皆が思うことに付いてもっと細かく条件とやったことを書かないと。 最初に誰でも思うのは、サンプルの調整ミスじゃないのか？ってことです。 ＞分画抽出したサンプルだと、その転写因子は薬剤刺激によりNとC両方で明らかに増加 つまり、このサンプルだけ濃度が高いのではないか？ということです。 それについてどう考察して、何をやったのか、 まずはそれをちゃんと述べてください。

(無題) 削除/引用 No.1502-2 - 2009/11/06 (金) 13:04:30 - c whole cell lysate はどのような方法で調製していますか。いまの抽出法ですべてのこの転写因子がきちんと回収できているかどうかは注意すべき点と思います。物理的な方法や、非イオン性界面活性剤などを使う比較的マイルドな方法だと特に。SDS−bufferで直接細胞を溶かしてみてもやはり差はないでしょうか。

細胞質分画でも核分画でも増えているのに・・・ 削除/引用 No.1502-1 - 2009/11/06 (金) 12:49:10 - 関西人院生 こんにちは．よろしくお願いします． 核内と細胞質をshuttlingしている某転写因子の発現と細胞内局在を調べています。薬剤刺激後にPierce社のキット(NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction Kit)を用いて核蛋白(N)と細胞質蛋白(C)を分離、IBで検出しました。nucleophosminとalpha-tubulinをそれぞれの分画のマーカーとして、きれいに分離していることを確認しています。 分画抽出したサンプルだと、その転写因子は薬剤刺激によりNとC両方で明らかに増加するのに、分画抽出しないtotal cell lysateをIBすると差が認められません・・・。 mRNAレベルでも差がないのですが、その転写因子はユビキチン-プロテオソーム系での制御も良く知られています。こちらもチェックすべきとは思いますが、IBの解釈そのものに悩んでいます。 助けて頂ければありがたいです。よろしくお願いします。

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