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(無題) 削除/引用 No.1502-27 - 2009/11/08 (日) 09:28:47 - 関西人院生 cさま 　ご親切にありがとうございました。 　局在についてはアデノウィルスでGFP融合タンパクを導入する実験をやっている最中です。初代培養なので導入効率は高くありませんが、観察には十分です。 　ここ数日、こちらを拝見してかなり勉強になりました。皆様ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.1502-26 - 2009/11/07 (土) 21:55:54 - c すみません。材料が腹腔マクロファージだったのを見落としてました。さきに書いたGFPーリコンビナントの部分は現実的でないですね。（報告あるかもしれないですが私はいま分からないのでとりあえずこの部分は忘れて下さい。）

(無題) 削除/引用 No.1502-25 - 2009/11/07 (土) 21:50:29 - c 細胞分画の方が解決までちょっと時間かかりそうな感じであれば、その間に免疫細胞染色の方も少しトライしてみたらどうでしょうか。実験目的は細胞内分布を正しく評価するということで、細胞分画でそれを成功させるのが目的ではないと思うので。 またHNを見ると院生の方のようですので、限られた時間の中で、という制約もあるとおもうので、自分自身の経験や反省もあって、ちょっとそう思いました。 もちろん免疫染色も固定法等で少し至適条件の検討が必要な場合もあるので容易にクリアな結果が得られるとは一概には言えません。でも異なる方法で多面的にみることで、何か手がかりが見つかることはしばしばあります。ちょっと忙しくなるけどそれだけの価値はあると思います。またGFPとかタグつけたリコンビナント蛋白質を発現させてlive cell imagingのような実験も準備してもいいかもしれないですね。週明けにでも一緒に研究しておられる先生と協議してみてはどうでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.1502-24 - 2009/11/07 (土) 14:13:23 - 関西人院生 う様 　ありがとうございます。 　細胞はマウスperitoneal macrophageです。この実験では10匹前後のマウスから得たマクロファージを60mm dish4-6枚に撒いています。2-3枚を刺激なし、2-3枚を刺激ありといった感じです。 　2-3匹単位でsacrificeし、細胞をプールして全てのdishに均等に撒いています。これを3-4回繰り返し、その都度dishに細胞を継ぎ足していく要領です。最終的には全てのdishに全てのマウスの細胞が同じ割合で混ざった状態で培養されるようにしています。 　DMEM/10%FCSに、L-929細胞のconditioned mediumを添加したものを培養にも刺激時にも使っています。確かに色んな刺激が入りまくりではありますが、今の所は刺激に対してサイトカインなどreasonableに動いてくれています。starvationは試したことはございません・・・。 　初代培養は分画抽出、免疫沈降とかやる時は大変です・・・。

(無題) 削除/引用 No.1502-23 - 2009/11/07 (土) 13:26:41 - う あぁ、すみません。 打ち間違えました。わざわざ指摘ご苦労様です。

(無題) 削除/引用 No.1502-22 - 2009/11/07 (土) 13:22:35 - ねうろん >[Re:21] ｌさんは書きました : > >ペレット側にいっているんじゃないかと指摘しているんです。 > > だったら、そう書けばいいのに。 > > ＞サイトゾルにもデタージェントレジスタントなものは存在しますから。 > > ですから、もしそれがあっても　同じ解けづらい条件なわけです。 > 含まれている量の違いがあれば（NとCで見まれているように） > > たとえ解けづらくあっても、 > 差があってもいいのではという質問だったと思ったのですが。 > そう質問者様は思っているから、私はシンプルに答えているのんですがねぇ。 あのー、せめて同一トピック内、名前（HN）は統一した方がよいと思いますよ。

(無題) 削除/引用 No.1502-21 - 2009/11/07 (土) 13:17:38 - ｌ >ペレット側にいっているんじゃないかと指摘しているんです。 だったら、そう書けばいいのに。 ＞サイトゾルにもデタージェントレジスタントなものは存在しますから。 ですから、もしそれがあっても　同じ解けづらい条件なわけです。 含まれている量の違いがあれば（NとCで見まれているように） たとえ解けづらくあっても、 差があってもいいのではという質問だったと思ったのですが。 そう質問者様は思っているから、私はシンプルに答えているのんですがねぇ。 まぁ、クロマチンの例え、解けづらいものの話はこじつけと本人も認められているようなので別にいいです、すみません。 あと、マクロファージも使っている者として、 ２倍から３倍とありますが、それはｎ＝２，３とありますが、 それは２、３人由来のマクロファージってことなら、 結構いい結果だと思います。 しかし、それを言うのは他人ではないと思います。 グループでディスカッションしてください。 あと、実験方針とか無責任なことを言うのは嫌いですが、 少なくとも経験者として、 マクロファージはサイトカインとか血清とかを抜いて培養すると劇的に 形とか変化して悪影響を及ぼしますが、 それらを抜いて(starvedですね)短時間なら培養しても問題ないです。 短時間なら。 starvedで薬剤を加えると、より結果に差がみられるときがあります。 マクロファージは結構サイトカインの刺激下で培養されていますので、 それらの刺激があると、ほかの刺激で起こることがあまり見えないことがありますので。 なので、２，３倍は結構多いと思います。 ほかの実験と混同して２倍ておいう差はどうかって言うのはいかがなものかと思いましたので、コメントしてみます。 しかし、無責任なコメントの類なので、あくまでボスと方針は決めてください。

(無題) 削除/引用 No.1502-20 - 2009/11/07 (土) 11:42:29 - 関西人院生 おお様 　そうですね。ひとまずBPB(-)のサンプルBufあたりを試してみます。週明けに指導者とも相談しなければ・・・。 　皆さま、本当に多くのアドバイスをありがとうございました！

(無題) 削除/引用 No.1502-19 - 2009/11/07 (土) 10:49:53 - おお >[Re:18] 関西人院生さんは書きました : > おお様 > > 　大変ありがとうございます。 > > 　細胞形態に違いはありませんでした。 > 　サイトゾリックのフラクションは核から分離したものをそのままサンプルBufと混ぜています。もう一回遠心する操作はありません。 > 　一方、核フラクションは遠心して上清を採用しています。ラストの沈殿をチェックしたことは確かにありません・・・。 > > 　細胞質分画で3倍前後、核分画では2倍前後の変化です。n=2-3でバンドを比較しても一貫してそのくらいの差が出ます。2倍では信憑性が低いでしょうか・・・。 いろいろな要因でぶれる事はあるので2倍か、、、どうだろうな ほんとに上がっているかなっている感じです。細胞の形態を 聞いたのもその理由の一部です。 刺激時間、濃度などを検討してもっとさが出そうなところ を探すのもてです。 まずはうさんがすでに指摘されていますように、トータルの タンパクをもう少し強い可溶化条件で抽出してみて(BPBのダイを含まない サンプルバッファーとか、ホットライシシバッファーのようなもので タンパク定量ができるものがいいと思います)、まあそれで 上がっているようだったら、発現がタンパクレベルであがっている "かもしれない"とぐらいにとって、次の実験をするほうがいいか とおもいます。 nucleophosminとalpha-tubulinはうごいてないですよね (ウエスタンのあなたのシグナルで見る限り)?

(無題) 削除/引用 No.1502-18 - 2009/11/07 (土) 10:04:54 - 関西人院生 おお様 　大変ありがとうございます。 　細胞形態に違いはありませんでした。 　サイトゾリックのフラクションは核から分離したものをそのままサンプルBufと混ぜています。もう一回遠心する操作はありません。 　一方、核フラクションは遠心して上清を採用しています。ラストの沈殿をチェックしたことは確かにありません・・・。 　細胞質分画で3倍前後、核分画では2倍前後の変化です。n=2-3でバンドを比較しても一貫してそのくらいの差が出ます。2倍では信憑性が低いでしょうか・・・。

(無題) 削除/引用 No.1502-17 - 2009/11/07 (土) 09:56:51 - あべちゃん >[Re:13] うさんは書きました : > RIPA　bufferで可溶化するもの、しないもの、それががあるから、 > 質問者さんは超音波処理しているんでしょう、きっと。 > （そう認識しているかはわかりませんが） > > しかしながら、クロマチン云々とうんちく言う前に、 > 仮に、クロマチンがRIPA　bufferで解けていなくても > 細胞質の分画で増加していることから、 > RIPA　bufferで調整したものが結果としてtotal cell lysateじゃなくても > シグナルの増加がみられるはずだ、という疑問じゃないんですか？ > > 小難しくくクロマチンがどうとか、意味がない話では？ > > つまり、ペレット側にいっているんじゃないかと指摘しているんです。 でも、質問者さんはご理解頂けたと思うので、よかった。

(無題) 削除/引用 No.1502-16 - 2009/11/07 (土) 05:47:51 - おお あ、そうそう明らかな増加と書いていますがどの程度の増加でしょうか、、、 2倍程度であれば単独のデーターとしては信じられないという話もあります。

(無題) 削除/引用 No.1502-15 - 2009/11/07 (土) 03:14:55 - おお >[Re:14] 関西人院生さんは書きました : > 　お付き合い頂いて本当に皆様ありがとうございます。 > > 　c様のご指摘はごもっともで、ありがたく拝聴しました。おっしゃるとおり、分画抽出の結果を尊重したいところですが・・・。 >[Re:13] うさんは書きました : > RIPA　bufferで可溶化するもの、しないもの、それががあるから、 細胞質、核で見られる増加したものが、 実はRIPAで可溶化できなかった不溶画分にきているのでは ないかということだと思いますけど、、、クロマチンは例であって、 サイトゾルにもデタージェントレジスタントなものは存在しますから。 サイトゾリックのフラクションは核から分離後遠心して不溶性の ものを除くプロトコールになってますか?それとも直接 サンプルバッファーでしょか? 核フラクションの直接サンプルバッファーですか? 核フラクションをRIPAで溶解すると量が変わらないという 可能性はありませんでしょうか。 あとはスタートの細胞の形態などに変化ないでしょうか?

(無題) 削除/引用 No.1502-14 - 2009/11/07 (土) 00:00:09 - 関西人院生 　お付き合い頂いて本当に皆様ありがとうございます。 　c様のご指摘はごもっともで、ありがたく拝聴しました。おっしゃるとおり、分画抽出の結果を尊重したいところですが・・・。 　一方、う様に代弁いただいた様に、C分画が含まれているはずのtotal cell lysateで差が出ないという現象はやはり理解できません。 　あとは、キットに伴うアーチファクトの可能性を排除するため、conventionalな分画抽出も試みる予定です。可能性は高くないとは思いますが・・・。キットのメーカーにも情報を確認した方がよいでしょうね。

(無題) 削除/引用 No.1502-13 - 2009/11/06 (金) 22:27:56 - う RIPA　bufferで可溶化するもの、しないもの、それががあるから、 質問者さんは超音波処理しているんでしょう、きっと。 （そう認識しているかはわかりませんが） しかしながら、クロマチン云々とうんちく言う前に、 仮に、クロマチンがRIPA　bufferで解けていなくても 細胞質の分画で増加していることから、 RIPA　bufferで調整したものが結果としてtotal cell lysateじゃなくても シグナルの増加がみられるはずだ、という疑問じゃないんですか？ 小難しくくクロマチンがどうとか、意味がない話では？

(無題) 削除/引用 No.1502-12 - 2009/11/06 (金) 20:55:04 - c 例えばの話ですが、同じ蛋白質でかつ核内にあってもクロマチンに強固にくっついている型のものと割とゆるくあるいはくっついていない型のものがあったとしたら、RIPA　bufferで可溶化しても後者は沈殿に、前者は上清に来る可能性もあります。この場合上清の方だけをみてこれをwhole lysateと思って話を進めると誤った結論に至る恐れがあるのは理解していただけると思います。RIPAbufferは名前から察するにもともとはimmunoprecipitationのサンプル調製のために考えられたものと思いますので、比較的強いとはいってもIPは邪魔しないくらいですから可溶化能には限界があると思います。複数回の実験で、分画したものではきちんと差が見えているとういことなので、その結果は十分尊重していいと思います。ただ蛋白質量の不一致等の技術的なミスの介入を排除するために、そのブロットを抗ヒストン抗体やチューブリン抗体などで再ブロットして、内在性のHistone とかチューブリンになどに対する、調べたいその蛋白質のシグナルの相対比で表して、処理群とコントロールで比べてみるとより確かなことがわかるとおもいます。

(無題) 削除/引用 No.1502-11 - 2009/11/06 (金) 19:26:14 - 関西人院生 追 cさま 　沈殿は流していません・・・。確かに確認すべきですね。ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.1502-10 - 2009/11/06 (金) 19:24:03 - 関西人院生 皆様、重ね重ねありがとうございます。 3回再現性（双方の結果が合致しないという意味で）を確認していて、ほとほと困り果てています。結局、増えているのかいないのか結論が出ないので、先に進むことができません・・・。 シンプルにSDS-sample bufに直接溶かしたlysateを調べてみます。

(無題) 削除/引用 No.1502-9 - 2009/11/06 (金) 19:20:44 - c RIPA buffer/sonicationで溶けなかった沈殿もちゃんとWBでチェックしていますか。

(無題) 削除/引用 No.1502-8 - 2009/11/06 (金) 19:17:19 - う total cell lysateの調整はいろいろと処理が多いので、 ここはSDS sample bufferに直接細胞を溶かして調整してみては？ それでも変わらないなら、それこそ謎です。

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