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(無題) 削除/引用 No.150-6 - 2009/03/08 (日) 21:08:52 - 一知半解 以前にも同様の議論がありました。 http://www.kenkyuu.net/cgi-biotech/biotechforum.cgi?mode=view;start=1;Code=2283

(無題) 削除/引用 No.150-5 - 2009/03/08 (日) 03:44:10 - まさ すいません。追加で質問させてください。 よく、文献でβactinなどでノーマライズして発現量を見ているものがありますがこれは、スキャナーで取り込んだ画像でβactinのバンドの強弱を計り、これを元に目的の蛋白のバンドの測定値を比較する方法ではないのですか？ コントロールのサンプルでstandardを作りこれを元に各サンプルのβactinを計測値を比較するのですか？

(無題) 削除/引用 No.150-4 - 2009/03/07 (土) 22:43:35 - 一知半解 ウエスタンのシグナルを定量することは、同じメンブレンに量を振った抗原を乗せて検量線を引きそれを基準にするようにしないと強弱以上の意味はありません。ましてや、あるバンドのシグナルを他のバンドのシグナルで割って比を出すようなことはナンセンスです。

(無題) 削除/引用 No.150-3 - 2009/03/07 (土) 13:32:26 - まさ スキャナーでの取り込みの際にコントラストがつくように写真を濃く撮りすぎていたような気がします。再度取り込み直して測定してみます。素早いご返答ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.150-2 - 2009/03/07 (土) 11:23:10 - qq まず、発色のウェスタンを定量するのはかなり（大変）困難です。 ケミルミ+フィルムか専用カメラ（Typhoonが万が一有るのならTyphoon）をお勧めします。 画像のバンドやスポットから定量するときは、明るさ（暗さ）とその面積を評価します。 ＞明らかに大きさが違うバンドでも と言っておられますが、これは明るさではなくバンドの面積が違うと言っているのでしょう。 その場合、 analyse>setmeasurementから AreaとIntegrated Densityにチェックを入れます。 Integrated Densityは、選択した領域の積算値ですから、Area x Mean とおなじです。 わたしは、Meanから適当なBlank（シグナルの無いところの値）を差し引いてから、Areaと掛け算します。 さて、そこで問題なのですが、 ＞明らかに大きさが違うバンドでもピークは250で平均がほぼ同じになります。 バンドの部分が250であるとのことですが、これは、バンドが真っ黒もしくは白抜けしていることになります。 測定することに意味が殆ど無いということです。中間調で取り込む必要があります。 スキャナーで取り込むとき、RGBでなく、48bitRGBもしくは16bit glay scaleで取り込んで下さい（Maxが4600とか65000になります）。 16bit-glayの場合、特定の色だけ取り込むことが出来るかもしれませんその方が、よろしいので試行錯誤してください。 透過型スキャナのほうが更に宜しいです。

ALP発色のメンブレンをImage Jで定量するには？ 削除/引用 No.150-1 - 2009/03/07 (土) 09:56:45 - まさ ウエスタン初心なのですごく初歩的で申し訳ございませんが、蛋白の定量をImageJでやったのですがうまくいきません。 画像の取り込みは、カラースキャナーにてRGB color tiff fileで取り込み、バンドをツールで選択しanalyze→measureでやってますが、明らかに大きさが違うバンドでもピークは250で平均がほぼ同じになります。（測定値で１０前後しか変わりません。）見た目は倍ぐらいの違いがありそうなのですがどうしたらいいでしょうか？

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