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ありがとうございます！ 削除/引用 No.1499-7 - 2009/12/27 (日) 00:49:30 - real-time様 質問したのがずいぶん昔になってしまったのに覚えていていただいてありがとうございます。 結局REST2008は私がやりたかった解析（と言えるほどのものじゃないんですけど）にそぐわず、エクセルでPfafflの式につっこんでやっています。でもいろいろ勉強になりました。ありがとうございました。

REST2009 削除/引用 No.1499-6 - 2009/12/25 (金) 10:40:11 - real-time 太郎様 もうご存知かもしれませんが、REST2009がQiagenのWeb siteからダウンロード可能です。 http://www1.qiagen.com/Products/REST2009Software.aspx?r=8042#Tabs=t2 解凍とインストールをしましたが、パスワードは聞かれませんでした。

ありがとうございます 削除/引用 No.1499-5 - 2009/11/07 (土) 07:47:19 - 太郎 real-timeさんありがとうございました。 増幅効率を考慮に入れた計算の仕方がわからなかったのがREST2008のwebsiteでいろいろ情報を得られてよかったです（その方法を使えばいいというのがわかっただけで実際のデータ処理に全く進展は見られないのですが）。 いまだにパスワードは送られてこないのでREST2008が使えないのですが、他に使いやすいフリーソフトウェアの情報はお持ちでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1499-4 - 2009/11/07 (土) 07:35:17 - Real-time 増幅効率を測定するためのサンプルRNAは、なるべく本実験で使う検体にトランスクリプトーム全体が似ているものが良いでしょう。実験のコントロールはどんな実験を行うかによって変わりますので、増幅効率を測定するRNAと異なることも多いです。RESTのパスワードはメールがクラッシュした時に消えてしまって、今は分かりません。

ありがとうございます 削除/引用 No.1499-3 - 2009/11/07 (土) 01:27:02 - 太郎 計算に必要なのは増幅効率だけであって、どのtemplateをスタンダードカーブ用に使ってもかまわないということでしょうか？ 今使っているのがBio-RadのCFX96というものでスタンダードカーブのサンプルに任意の値を割り振ることはできるし、増幅効率も数値で出してくれるのですがそれ以上の解析ができないソフトウェアで、同じプレート上で同じtemplateでやったときは単純に出てきた相対値の割り算をするだけでよかったのですが、違うプレートで違うtemplateの場合手動でやろうにもどのように増幅効率を使っていいかわからずに困っていました。教えていただいたREST2008のマニュアルのところに式があったのでやってみようと思います。 ダウンロードしたREST2008を解凍するのに必要なパスワードを送ってもらうためにメールを送って、一日待ってみてもパスワードが送られてこないのですが時間がかかるものなのでしょうか？もしご存知でしたらメールで送っていただくことは可能でしょうか？（ほんとうはよくないことなのでしょうが・・・）

(無題) 削除/引用 No.1499-2 - 2009/11/06 (金) 06:28:19 - Real-time 厳密に言えばあなたの言うとおりですが、相対的定量を行う際にはPCR増幅効率が安定していることを前提に、別のPlateで計算した増幅効率をターゲット/リファレンスの計測に使っても構わないように思います。ABIの7500のソフトウエアでは複数プレートのデータをまとめて計測できるシステムになっていますし、 REST2008 http://www.gene-quantification.de/download.html のようなソフトウエアもあります。 まず、安定したPCR増幅効率を出せるようなプライマー、反応条件を検討してその際に最適条件下でのPCR増幅効率も計算しておき、その後に本実験を行えば、一度に実験するプレート数も減らせると思います。 どこのメーカか忘れましたが、cDNAを含むリアルタイムPCR反応液を１時間以上置くことを禁じていたと思います。多数プレートの反応時には、PCR反応中に次のプレートを準備するとよいでしょう。 またリファレンスは文献等で、貴方が行う実験の条件（または似たような条件）では変動しないと言うことを確認したうえ、少なくとも数個の遺伝子を用いることをお勧めします。

real-time PCR　相対定量の際のスタンダードカーブについて 削除/引用 No.1499-1 - 2009/11/06 (金) 05:19:49 - 太郎 初歩的な質問ですみませんがよろしくお願いします。 mRNA発現量の変化をみるだけなので、とあるサンプルを希釈してスタンダードカーブとして使っています。 例えばtriplicateのサンプルセットA,B,Cがあったとして、サンプル数がとても多いのでA,B,Cそれぞれにつき別々のプレートを用意しなければならず、しかもtarget geneとreference geneもひとつのプレートに乗り切らないので別々のプレートでやらざるを得ず、 サンプルセットＡ−target gene用, reference gene用 サンプルセットB−target gene用, reference gene用 サンプルセットB−target gene用, reference gene用 の計６つのプレートを作らなければならない場合について質問です。 6つのプレートで別々のtemplateをスタンダードカーブ作成に使ったら、Ct valueに対比させる相対値（相対的濃度値）がプレートごとに違ってきてしまうので相対定量は不可能ということになりますか？ それともどこかを基準にして数値をあわせたらなんとかなる等何かアドバイスがあったらよろしくお願いします。なんだか考えていたら混乱してきてしまったので皆様の知恵をお借りすることにしました。

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