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(無題) 削除/引用 No.1498-3 - 2009/11/07 (土) 03:59:12 - DHC cさん有難うございます。 > total lysate が一番きょう雑蛋白質が多くて、上清と沈殿はそれぞれある程度きょう雑蛋白質は減っているので、遠心はある意味で濃縮になっていると言えるとおもいます。 total lysateで見られる高いバックグラウンドが分画によって減っている事から、cさんの仰る通り濃縮、精製のような効果は高いようです。 >つまり総蛋白質あたりのダイニンH鎖の割合は、Total lysateよりもSおよびPの方が高いわけです。 しかし不思議なもので他の検出したタンパク質の多く（細胞質、細胞骨格、膜タンパクを中心に20位）はおおよそ Total=S1=S2+P1、またはTotalの方が数倍から1/2倍 S1より濃い（薄い）という結果になります。 このTotalの方が濃いというのは例えば核にも局在しているようなものは1,000gの遠心で除かれてしまった為かと思います。 一方cさんの仰るように、total<S1のタンパク質は、重量当たりの割合の変化によって見た目上S1で増えているのかも知れません（たしかにこの分画法で細胞質に多く局在するタンパク質にはその傾向がありますが、絶対ではありません）。ただ私の場合重鎖のみが顕著なのです（というか検出できません）。ダイニン重鎖は他のタンパク質に比べてこの条件で非常に（異常に？）可溶化されやすいとか有り得るのでしょうか？としてもそもそも検出すら出来ないのは抗体感度の問題？またはその他？ >whole lysateを濃度を何点か振ってみて検出できるアプライ量をを知たうえで、その蛋白質濃度でそろえてWesternすれば３つの画分にシグナルが見えているデータは出せると思います。 サンプルの都合上そう極端なことはできませんでしたが、御指摘の通り、S1他で普通に検出できる5倍のTotal lysateを流してみましたがダメでした。 次回サンプルはもう少し濃いめのサンプルを調整し、アプライ量を稼ぐつもりですが、、、 cさん含め同様の実験で、タンパク質重量当たりSup分画に来る傾向の強いタンパク質に出会った事のあるかたいらっしゃいますでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1498-2 - 2009/11/06 (金) 22:04:39 - c total lysate が一番きょう雑蛋白質が多くて、上清と沈殿はそれぞれある程度きょう雑蛋白質は減っているので、遠心はある意味で濃縮になっていると言えるとおもいます。つまり総蛋白質あたりのダイニンH鎖の割合は、Total lysateよりもSおよびPの方が高いわけです。なので等蛋白質量で比較すればSとPに検出できてwhole lysateで検出できないのは、ダイニンの量的な問題ではないかと思います。whole lysateを濃度を何点か振ってみて検出できるアプライ量をを知たうえで、その蛋白質濃度でそろえてWesternすれば３つの画分にシグナルが見えているデータは出せると思います。

細胞質ダイニン重鎖の検出 削除/引用 No.1498-1 - 2009/11/06 (金) 04:59:14 - DHC マウス脳または初代培養神経細胞を材料とし、ダイニン関連タンパク質の検出をしています。 材料をbuffer (25mM Tris, pH7.4, 250mM Sucrose, 1mM EGTA, protease inhibitor cocktail)で懸濁後、一部をtotal lysateとし、残りをさらに1,000g 10min遠心、上清（S1）を取り、これをさらに100,000gで遠心し、上清（S2）、沈殿（P1）と分けています。全ての分画は最終的にfinal 1XのLaemmli sample bufferで懸濁後、sonication、boilを経て、サンプルとしています。total lysateのタンパク質濃度をS1に合わせ、S2、P1とともに等量をSDS-PAGEゲルにアプライ、santa cruzのanti-Dynein HC抗体（R-325）で検出しています。 問題点はtotal lysateのダイニン重鎖のみ検出できない点です。 他の分画のダイニン重鎖は検出できる点、全ての分画でDynein Intermediate Chain、dynactin1が検出できる点から、トランスファー、またはサンプルの入れ忘れ等の問題ではないと考えております。他の分画で見られるバンドも「非常にきれい」とは言えないのですが、それでもはっきりとしています。気になる点は、特にtotal lysateにおいてバックグラウンドが高い、と言う事です。しかし、バンドが見えなくなる程のバックグラウンドでは有りません。 アプライ量、抗体濃度、時間をいじりましたが、バックグラウンドがあがるだけでダメでした。 total lysateからダイニン重鎖を検出するのに何か特別なTipsでもあるのでしょうか？幾つか論文をあたってみましたが、それらしき記述を見つけられませんでした。 どなたか経験の有る方、無くとも何か思い当たる方、コメント頂けると幸いです。 また場合によっては抗体の買い替えも考慮に入れているのでお薦めの抗体が有ったら教えて下さい。 宜しくお願い致します。

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