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(無題) 削除/引用 No.149-3 - 2009/03/07 (土) 13:17:40 - 素人ですが 核は昔とったことあります。等張の緩衝液にトライトンみたいな非イオン性の界面活性剤を0.5%くらいとあと核膜を安定化するためにMgCl2入れてやってました。遠心は800xgでやりました。論文によっては500とか1000xgと書いてあるのもありました。とりあえず低速でやるということです。ウェスタンとかで見ると、この方法だと核画分へのチューブリンなどのコンタミも非常に少なくて、核蛋白質の漏れも少なくて、なんかいいかんじの核でした。界面活性剤をいれないと核の外膜にくっついた細胞骨格とかそれにくっついた細胞質の蛋白質も一緒に連れてきてしまうのでコンタミがけっこう多いいです。残りの上清はポストニュークリアフラクションとよんでました。それは細胞質だけでなくミトコンドリア、小胞体の成分も含まれるからで、正確には細胞質画分とはいわないとおもいます。引用文献とかには気をつけていないのでわかりませんが、みんな知ってたので、昔からある普通のやりかたのようです。

(無題) 削除/引用 No.149-2 - 2009/03/07 (土) 08:05:26 - 通りすがり >一般に、核抽出物の調製法は、 >最初に低張液で細胞を壊し、 >max回転で遠心 (上清：細胞質画分を除去) いや、max回転するの一般的でないですよ。 たぶんどっかで間違った情報が混ざってます。 普通というかオリジナルのDignamの方法は低速だったはずです。 ↓参照 Accurate transcription initiation by RNA polymerase II in a soluble extract from isolated mammalian nuclei. J D Dignam, R M Lebovitz, and R G Roeder Nucleic Acids Res. 1983 March 11; 11(5): 1475–1489. >１回目のmax回転で核をまず落とすのだと思いますが、核だけを得るために核 >を落とすのに(核だけなら500gで沈殿するようです) 何故このような高回転が >必要なのでしょうか？ おっしゃるとおり核だけを得たいなら低速で遠心すべきです。 >そもそも、細胞質画分とはどの細胞内小器官を含んだものまでを言うので >しょうか？ 正確に言うとこのメソッドは核成分をenrichさせるために開発された方法で、 細胞質成分は核成分以外の途中の段階で抽出されるそれ以外の成分という意味でしかないので、結構あいまいですよ。 それと >次に高張液を加えることにより核内の蛋白質を抽出する。 >max回転で遠心 (上清：核画分を得る) この後の沈殿とか調べるとわかりますが、 細胞質と核の両方の不溶性のタンパク(細胞骨格とか一部のクロマチンのタンパク)とか結構含まれてますので 少なくとも、最初の細胞質画分で得られるのに全ての細胞質の小器官や成分が含まれていることはないのは確かでしょう。

核抽出物の調製について 削除/引用 No.149-1 - 2009/03/07 (土) 06:15:42 - Cell 一般に、核抽出物の調製法は、 最初に低張液で細胞を壊し、 max回転で遠心 (上清：細胞質画分を除去) 次に高張液を加えることにより核内の蛋白質を抽出する。 max回転で遠心 (上清：核画分を得る) です。１回目のmax回転で核をまず落とすのだと思いますが、核だけを得るために核を落とすのに(核だけなら500gで沈殿するようです) 何故このような高回転が必要なのでしょうか？ max回転なら核と共にミトコンドリアや葉緑体も沈殿してくると思いますが、これらは、高張液で核内の蛋白質を抽出する際には、壊れて中身が出てきて、核抽出物とコンタミしないのでしょうか？ そもそも、細胞質画分とはどの細胞内小器官を含んだものまでを言うのでしょうか？ 調べているのですが…なかなかはっきりと分かりません。 ご存知の方がおられましたら、宜しくお願いいたします。

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