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(無題) 削除/引用 No.1489-6 - 2009/11/07 (土) 11:20:33 - m みなさん丁寧な回答ありがとうございました。 現在、クローニングをセレクションメディウムで行っているので、セレクションをかけずにまずは細胞を増やすことから始めてみます。 あと、コンディションメディウムも試したみたいと思います。 細胞自体が他から頂いた細胞なので、自分で遺伝子を導入できないため、限界気釈法で増やそうと検討中です。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.1489-5 - 2009/11/06 (金) 10:01:45 - tm 限界希釈で増えてこないようでしたら，例えば100mm plateぐらいでtransfectionしてそこから選択をかけて出てきたコロニーをクローニングシリンダーで拾うというのはどうでしょうか？ 例えば自分がG418で選択をかけたときは，よく増える細胞だったのでtransfection後２〜３日でコンフルエントになるのでそこで一度継代します．この時点ではまだ選択をかけていません．継代後１〜２日で細胞が問題なく増えてきていることを確認してから，選択をかけていきます．G418だと１〜２週間ぐらいすると導入されていない細胞がきれいに死んでいって，うまくいけばコロニーがいくつか出てくると思うので，それをクローニングシリンダーで回収していきます． あと薬剤の濃度は細胞によって違うのでちゃんと検討した方がいいと思います．

(無題) 削除/引用 No.1489-4 - 2009/11/06 (金) 08:56:57 - ~ 親株のセレクション無しでその希釈で生えてくるのでしょうか？ 生えてこないのであれば、コンディションドメディウムを使えば生えてくるかもしれません。 軟寒天培地であれば生えてくるかもしれません。 親株は生えるのであれば、薬剤濃度が厳しいのかもしれません。 マスカルチャーでは多くの細胞で分解できる場合でも、シングルセルだと一人で分解しないといけないため、薬剤濃度を落とす必要があるかもしれません。 実験によっては使えないかもしれませんが、一度親株からシングルクローンを取得して、その細胞に遺伝子を導入すれば、再度のクローニングが容易になるかもしれません。 (遺伝子導入効率の高いクローンを得たり、分化能を持つ細胞だけが欲しいときに使っているのを見たことがあります)

(無題) 削除/引用 No.1489-3 - 2009/11/06 (金) 01:12:46 - あべちゃん >[Re:2] cさんは書きました : > ２つ考えられるのですが、ひつつは、一般的に細胞の密度が非常に低いときは増殖がとても遅かったり、ときに死んだりすることはあります。ただ低密度に対する耐性は細胞によってかなり差があると思います。少なくともHeLa細胞ではシングルセルにしても死ぬということはありませんでした。もしもお使いの細胞が低密度に弱いようであれば、実験目的の許す範囲で別の細胞株に変えてみるということも検討されてはと思います。 cさんがご指摘の低密度が問題であれば、co-cultureしてみてはどうでしょうか？おそらく、遺伝子導入の際には薬剤耐性遺伝子も付与しているでしょうから、有る程度量が増えてから、あとで再び薬剤選択する。 たとえば、私は、限界希釈し、その上から、薬剤感受性の同じ基株の細胞を1,000 cells per well (96 well plate)でやったりします。

(無題) 削除/引用 No.1489-2 - 2009/11/05 (木) 21:29:44 - c ２つ考えられるのですが、ひつつは、一般的に細胞の密度が非常に低いときは増殖がとても遅かったり、ときに死んだりすることはあります。ただ低密度に対する耐性は細胞によってかなり差があると思います。少なくともHeLa細胞ではシングルセルにしても死ぬということはありませんでした。もしもお使いの細胞が低密度に弱いようであれば、実験目的の許す範囲で別の細胞株に変えてみるということも検討されてはと思います。 もう一つは、導入した遺伝子が途中で抜けてくる可能性もあると思います。導入後の安定発現細胞の選抜を少し時間かけてやった方がいいと思います。選択培地に変えるとはじめにかなり死ぬとと思います。ただここで生き残った見かけ上は安定な細胞でも、その後もう数日間培養してると遅れてゆっくり死んでいくものが結構あります。ゆえにここでしっかり選抜かけてから、クローニングに進んだ方がいいと思います。クローン間で発現量の違いが大きいこともあるので、クローンはなるべく多めにとっておいた方がいいと思います。

クローニング細胞が育たない 削除/引用 No.1489-1 - 2009/11/05 (木) 20:42:51 - m 私は現在遺伝子を導入した細胞を用いて実験を行っています。導入細胞の陽性率を上げるため、限界希釈法を用いて１個の細胞のクローニングを行っています。途中までは細胞がわずかにコロニーを作るのですが、途中から細胞が死んでしまい、コロニーが成長しません。何か良いアドバイスがありましたらご教授ください。培地は、10％FCS-DMEMです。

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