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(無題) 削除/引用 No.1480-8 - 2009/11/05 (木) 15:25:44 - in situ って、書いてからよく読んだら、おおさんがすでに書いていらっしゃいますね。 失礼しました。

(無題) 削除/引用 No.1480-7 - 2009/11/05 (木) 15:22:34 - in situ 自分ごときがこういったテーマにコメントしていいのかどうかわからないのですが、一応思いついたことがあるので書かせていただきます。 5'、3'のnoncoding regionがmRNAのターゲッティングに重要であり、mRNAのターゲッティングがタンパク質の発現部位に影響を与えるというのを読んだことがあります。 その論文ではbasal、apicalの局在を論じていましたが、ミトコンドリアでもそういうのがあるとしたら、ORFだけでなく前後の領域もクローニングしたら発現にも影響を与えるのでは？と。 いかがでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1480-6 - 2009/11/05 (木) 15:18:59 - p 可能性はわかりません。 結局、150は発現しそうというは人の勝手な想像であって それを予想することはあまり意味がないのではと思います。

(無題) 削除/引用 No.1480-5 - 2009/11/05 (木) 15:03:15 - あべちゃん >[Re:4] pさんは書きました : > 発現した細胞が死んでいるんじゃないですか？ pさん、ありがとうございます。 確かに、否定はできません。 ただ、元々発現量が１００だったものが、１１０になった途端に死に始めるというのが、可能性としてどれくらいあるのでしょうか？ せめて、150くらいの発現量がある細胞が取れても良いと想像していたのですが。 あと、RNAiでノックダウンして、入れ戻し発現した蛋白質量はやっぱり、元の内在性の物の10分の1未満なんですよね。ちょっと煮詰まってます。 ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.1480-4 - 2009/11/05 (木) 10:43:21 - p 発現した細胞が死んでいるんじゃないですか？

(無題) 削除/引用 No.1480-3 - 2009/11/05 (木) 10:13:09 - あべちゃん >[Re:2] おおさんは書きました : > 経験も詳しい知識もないのですが、、レスもついてないですし > あげることで貢献できればと、、、、、 ありがとうございます。レスしてもらえるだけでもありがたいです。 > エンドとの量の比較ははタグとかでSDSPAGEで移動度の差 > を見ているのでしょうか? タグ付き、タグ無し、で発現させ、タグに対する抗体、目的蛋白質に対する抗体でウエスタンしました。が、やはり、10分の1未満です。 > ミトコンドリアを単りしてからのウエスタンとかタンパクの > 検出をされているのでしょうか、、、ターゲッティングがうまく行かないのか > と言う所が気になります。 ミトコンドリアと細胞質の比較もしております。細胞質にはほとんど発現は認められません。 > > えーとhsp70でしたっけ、ミトコンドリアターゲッティングのシャペロン > として働くのは。これの発現が高い細胞を選ぶとか、共発現させてやるとか > どうでしょうかね。 これは、まったくノーマークでした。共発現について検討してみようと思います。 > あとはmRNAのUTRとかになにかシグナルがあって、ミトコンドリアタンパク > が合成されるような場所にトランスポートされるみたいなことが > あるのでしょうか、、、、 あります。ある種の遺伝子では、AKAP121というのがミトコンドリア標的遺伝子mRNAの３UTRを認識して 、ミトコンドリアへ誘うそうです。 ただ、私はコーディング領域しかベクターに組み込んでいないので、これを考慮すべきかもしれないです。 いつも、ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.1480-2 - 2009/11/05 (木) 10:04:23 - おお 経験も詳しい知識もないのですが、、レスもついてないですし あげることで貢献できればと、、、、、 しかしおそらくエンドより強いプロモーターでmRNA作っている にもかかわらずエンドより少ないというのが謎ですね。 細胞を使った研究のご経験は可也あるかと思いますので、 トランスフェクションとか基本的なところでの話は 必要ないかとおもいますので、本当に不思議です。 エンドとの量の比較ははタグとかでSDSPAGEで移動度の差 を見ているのでしょうか? ミトコンドリアを単りしてからのウエスタンとかタンパクの 検出をされているのでしょうか、、、ターゲッティングがうまく行かないのか と言う所が気になります。 えーとhsp70でしたっけ、ミトコンドリアターゲッティングのシャペロン として働くのは。これの発現が高い細胞を選ぶとか、共発現させてやるとか どうでしょうかね。 あとはmRNAのUTRとかになにかシグナルがあって、ミトコンドリアタンパク が合成されるような場所にトランスポートされるみたいなことが あるのでしょうか、、、、 うーんアドバイスにはならないですね。まさに雑談です。

ミトコンで過剰発現 削除/引用 No.1480-1 - 2009/11/04 (水) 15:50:27 - あべちゃん お世話になります。 ミトコンドリアにある蛋白質をexogenousに発現させました。 しかし、発現量が少なく（内在の10分の1未満）、もう少し増やしたいと考えました。 遺伝子導入はトランスフェクション、レトロウイルス感染で行いました。 そこで、ミトコンドリア標的シグナルを、目的蛋白質の物からCOXVIIのプレシーケンスにしたり、それを2つ重ねたりなど行いましたが、あまり発現量は改善しませんでした。 せめて、内在性と同じくらいの発現量がほしいと思っています。 何か、他にミトコンドリアで発現量を増やす為の工夫をなさった経験などありましたら、お教え願えませんでしょうか？ よろしくお願いします。

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