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(無題) 削除/引用 No.1480-28 - 2009/11/06 (金) 08:15:25 - Tb >[Re:22] あべちゃんさんは書きました : > ベクターは東大の北村先生から頂いたpMXを使っていましたが、 pMXsはIRES-GFPが入っているものでしょうか？もしそうなら、GFPの強度は空の場合、あるいはほかの遺伝子を入れた場合と比べて問題ありませんでしたか？ベクターに組み込む配列によりGFPの強度に多少の強弱があることは経験しておられると思いますが、時に異常に（通常の数十分の一）にしかならないことを私は経験したことがあります。CDSにmRNAを不安定化する配列があるとしか思えないくらいに。あべちゃんさんのケースがこの場合に当てはまるのかどうか聞いてみたく思いました。 ちなみに、北村先生のベクターはpMXではなくて、“pMXs”です。実は私自身、北村先生にpMXと言って（書いて）しまい、「もしかしてそれはpMXsのことを指しているのですか？」とチックとやられたことがあります。

(無題) 削除/引用 No.1480-27 - 2009/11/06 (金) 08:00:19 - おお >[Re:26] ？さんは書きました : > あと、確かに想像することは大事ですが、研究には時間も限られています。 > ネットで想像し合っている時間があることがうらやましいですが、 > あーだこーだ言うよりもスパッと方針を変えることが重要なときもあります。 > > 頑張ってください。 > > "確かに想像することは大事"これは"スパッと方針を変えること"のプロセスともいえるのではないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.1480-26 - 2009/11/06 (金) 07:54:36 - ？ 一応、突っ込みます。 exogenousなやつを認識させるとき使う抗体は、かなり使えると確認済みですよね。 違う抗体の横の比較はあてにならないですよね。 あと、確かに想像することは大事ですが、研究には時間も限られています。 ネットで想像し合っている時間があることがうらやましいですが、 あーだこーだ言うよりもスパッと方針を変えることが重要なときもあります。 頑張ってください。

(無題) 削除/引用 No.1480-25 - 2009/11/06 (金) 05:55:51 - おお >[Re:19] あべちゃんさんは書きました : > >[Re:13] pさんは書きました : > > ＞ミトコンドリアと細胞質の比較もしております。細胞質にはほとんど発現は認められません。 > > > > このことも含めて考えると、 > > UTRをいじるのはあんまり劇的に変わるものじゃないと「想像」するのは私だけでしょうか。 > > pさんの至適、もっともかと思います。 もとのpさんのコメントまでくだってないですが、 pさんのこのコメントに関して、コメントをお示しになる前から 推測をしていたことがあります。 例えばERにターゲッティングされるタンパクのかなりはリボソームで 翻訳が開始された直後、シグナルペプチドが合成された時点で いったん停止するようです。そのあとSRPがシグナルペプチド を認識しER表面にリクルートされ、合成が再開されるようです。 なのでSRPの認識なしではいくらサイトゾルにたくさんmRNAがあっても 合成が終結しませんのでサイトゾルではその手のERタンパク質(膜たんぱく質) はサイトゾルでは合成されないという解釈になります。 ミトコンドリアはERでないのでおんなじかどうか分からないと指摘されると 反論すべく直接的実験事実はないか、存じ上げていません。 しかしながら、ミトコンドリアタンパク質(核にコードされている)の合成、膜通過の機構は類似点が可也あるようです。 私の最初の質問の意図はその辺の探りの意味もありました。 勿論サイトゾルで発現していた方が解決の糸口がつかみやすいだろうな という気はしていましたが。

(無題) 削除/引用 No.1480-24 - 2009/11/06 (金) 02:50:38 - おお ここは思い切ってリコンビナントを合成してタンパクを トランスフェクションするというのをやってみればどうでしょうか と無責任なことをいってみる(ターゲットシーケンスはつけて 合成する必要がありますが)。 えっと私がミトコンドリアのタンパクを合成するような場所とか 書いたのが原因でいろいろと混乱しているようですけど、 その指摘に対して回答がある程度でてますけどコメントさしあげます。 ますミドコンドリアはDNAを持っていて独自の翻訳、転写システムを もっています(記憶が確かならミトコンドリア用のtRNAの一部は 核でコードされていると思いますが、間違っていたらご指摘ください)。 ミトコンドリアのDNAはミトコンドリアで必要なすべてのタンパクを コードしていません。ATPaseにかんしても10個とか可也の数のコンプレックス からなるタンパクの内一部が細胞の核でコードされています。 不思議なことに生物間でどのコンポーネントが核にコードされているか とか違ったりしています。 核でコードされているタンパクはもちろん他のサイトゾルなどのタンパク と同じようにmRNAが合成され、サイトゾルのフラクションで翻訳がなされます。そのご、ミトコンドリア内にトランスポートされるわけです。 で最近mRNAは漠然とサイトゾルの空間で翻訳されているのではなく、必要な場 に輸送されて合成されているという観察結果が増えてきています。 シナプスで必要なものはシナプス近辺にmRNAが移行してそこで合成されるとか、、、なぜこういうことが起こっているかは勿論たんぱく質や移行した場所によってそれぞれでしょうけど、効率よく必要な場所で合成される というのか一つの解釈かとおもいます。 ミトコンドリアのばあいは、よく分からないのですが１度ミトコンドリア 近傍かミトコンドリア膜のサイトゾル側でリボソームが集まってそこで ミトコンドリアの(核でコードされる)タンパクを合成して、ミトコンドリア へのトランスポートと翻訳がカップリングしているような図をみたことが ありますので、UTRにそのカップリングしているシステムに移行するような シスエレメントがあるのではと想像いたしました。 あべちゃんさん(あるいはそういう総説や文献を読まれた方)、みなさまこの辺 興味がありそうなので、リファレンスとかそういうラボがホームページで示している図とかあれば引用されてはどうでしょうか?

(無題) 削除/引用 No.1480-23 - 2009/11/06 (金) 01:08:09 - あべちゃん >[Re:18] 教えて下さい。さんは書きました : > ミトコンドリアとか全然素人なんで勉強のために教えて下さい。 核にコードされています。後者の場合、教えてください。さんの仰るとおりでよいと思いいます。 ミトコンドリアDNAにコードされた遺伝子を外からという実験を私はやったことがないので分からないです。 >ミトコンドリア蛋白質とかはなんか複合体と作っているのが多いような印象があるのですが、サブユニットとか一つだけ量が増えても、他のパートナーの量が変わらなければ、複合体からあぶれたものばかり増えるだけでそういうのは相手がいないから不安定で結局分解されてしまうような感じもするのですがそういうことはないのでしょうか。 そうですね。例えば、ATP合成酵素の活性中心であるサブユニットは非常にアグリ安いです。大腸菌に発現させても可溶性画分にはほとんど含まれません。なので、コンプレックス内にアセンブリされなかったものは、おそらく、ミトコンドリア内で速やかに分解されていると思います。それは、私の想像＋フリーのサブユニットは検出できない実験事実から。 千夏さんのご指摘もありましたように、分解の線も考慮しようと思います。内在性の物は分解されず、exogenousなものが分解されるというのであるとすれば、おもしろそうです。 早く論文にしろと怒っているボスには、叱られそうですが、また、少し遠回りしそうです。

(無題) 削除/引用 No.1480-22 - 2009/11/06 (金) 00:56:02 - あべちゃん >[Re:17] 千夏さんは書きました : > 実は私も「発現量が少なく（内在の10分の1未満）」というのには興味があります。というか、少なくとも私はこれをみて、「発現してないだけじゃない？」と思いましたｗ 千夏さん、ありがとうございます。 もしも、発現していないのであればエピトープタグで検出されないはずですが、そうではないのです。 トピ内でも触れましたがw > > mRNA levelでの発現を確認したかどうか？ yesです。 > yesならlysosomal inhibitorやproteasome inhibitorレスキューされるかどうか？　それは核DNAにコードされているのか、mtDNAにコードされているのかどうかってところでしょか。vectorを新しいのに入れ替えるのもよくきくおまじないなので、やってみては？？ inhibitor実験はしていないです。核にコードされています。 ベクターは東大の北村先生から頂いたpMXを使っていましたが、LTRプロモーターよりもCMVプロモーターがよいのではと思い、クロンテックのpLPCXを使っても見ましたが、ほぼ変化なしです。 > あるタンパク質を想定していうのであれば、pさんの推察通り細胞が死んでいるんでしょぅ。apoptosisの阻害剤でどうか。またmitophagyが誘導されている可能性もありますよねー。膜電位かミトコンの分裂融合関連ならば！ > 目的蛋白質の生理的な部分には触れにくいのです。 が、例えば千夏さんの仰るような、目的蛋白質の機能がtoxicに働くなどして、その結果として、低発現株しか取れないとします。 私は、RNAiで目的遺伝子の発現を免疫ブロットではほとんど検出できない細胞を得ました。それを利用して、発現の入れ戻し実験をしました。しかし、その際も、exogenous目的蛋白質の量は本来の内在性の物には遠く及ばないのです。 素人考えかも知れませんが、もし、生理的機能が細胞にtoxicに働いた結果であるならば、少なくとも内在性蛋白質の量と同程度くらいの発現細胞が得られても良いのではないか？というふうに考えています。

(無題) 削除/引用 No.1480-21 - 2009/11/06 (金) 00:45:02 - あべちゃん >[Re:16] ？さんは書きました : > ここは自分の考えと違うものを否定するところですか？ ？、レスありがとうございます。 何も否定していません。勝手な想像は良くないという趣旨だと捉えたので、想像するのが醍醐味だと考える私なりの意見を述べたのみです。 ただ、そのことが、pさんを怒らせてしまったので、もう少し、文字にして意思伝達するときは（e-mailもそうですが）、ストレートに書きすぎず、気を付けようと思います。 > ちなみにあべちゃんがどういう書き込みをしていたかなんてよく知らない者です。 > > ＞タグ付き、タグ無し、で発現させ、タグに対する抗体、目的蛋白質に対する抗体でウエスタンしました。が、やはり、10分の1未満です。 > > どうやって10分の1未満確認したのかちょっと興味があります。 > １０分の１というのはあくまで感覚的な物です。しかし、もしケミルミでシグナル比を取れば、２オーダーくらいは違うくらいのシグナル差です。具体的な実験で言うと、数秒で内在性蛋白質のバンドが検出できるのに、３０分以上露光しないとexogenousな蛋白質の方は検出できないという具合です。 よろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.1480-20 - 2009/11/06 (金) 00:39:41 - あべちゃん in situさん、度々ありがとうございます。 >[Re:14] in situさんは書きました : > mRNAが細胞内小器官にターゲッティングされ、そこにリボソームがやってきて翻訳されるという機構が最近分かってきていると認識しています。 私の知る限り、それはAKAPが関与するシステムですか？それとも違う機構であるなら、お教え願えませんか？

酸素無いのは辛い 削除/引用 No.1480-19 - 2009/11/06 (金) 00:36:20 - あべちゃん >[Re:13] pさんは書きました : > 想像と妄想は違うと思うだけです。単に１つの可能性だけについて > どうか、と言われたのに対しての書き込みをしただけであるのに > そう書かれるのはちょっと。 pさん、怒らせてしまったようで、わざわざレスしてくださったのに申し訳ありません。ただ、150という想像は、勝手な予想や想像ではないんです。 今まで、色々な遺伝子（これは、ミトコンに局在する遺伝子ではありません）では、内在性遺伝子の十倍から数十倍、見かけ上（免疫ブロットで）、発現量が認められていたのに、ミトコンに局在する遺伝子では、今までのところ、内在性の遺伝子よりも遙かに発現量が低いという事実がありました。 それで、最初のトピック立ち上げの際にも書きました細工などもしましたが、顕著な変化はありませんでした。 なので、１５０という数字自体には意味はありませんが、今まで細胞質や核に局在する蛋白質なら内在蛋白質の量よりも多く発現されることを期待したのですが、そうではないのです。 そこで、細胞生物学はそれなりに長い間やっているつもりですが、ミトコンドリアについては、ここ５年ほどと日が浅いので、色々な方の意見を伺い、 例えば、ミトコンへexogenousに発現させるには何かコツがあるのかな？という所も含めて、トピックを立ち上げさせていただいた次第です。 > 私にはわからないのですが、 > > 5'、3'のnoncoding regionがmRNAのターゲッティングに重要であり、mRNAのターゲッティングがタンパク質の発現部位に影響を与えるというのを読んだことがあります。 > > その論文ではbasal、apicalの局在を論じていましたが、ミトコンドリアでもそういうのがあるとしたら、ORFだけでなく前後の領域もクローニングしたら発現にも影響を与えるのでは？と。 > これらのことから考えられるのは、 > mRNAがミトコンドリアに局在して、翻訳の場がミトコンドリアということでしょうか？ 私の知る範囲では、2007年頃にAKAPという蛋白質のKHドメイン（RNA結合モチーフ）が、ミトコンドリアへ局在する蛋白質をコードしたmRNAの３UTRに結合し、ミトコンドリア表面で蛋白質へ翻訳され、効率的に蛋白質がミトコンドリアへ輸送されるのではという論文がありました。 in situさんが、この論文のことを指摘されているのか、不明ですが、私の知るところでは、こんな感触で、受け止めました。 > それだと、もともとミトコンドリアで翻訳されないmRNAだとしたら、 > コドンがどうとか面倒なことになるのでは？ ミトコンゲノムにコードされた遺伝子はミトコン内部で翻訳されるので、面倒なことになりそうですね。 しかし、私が注目している遺伝子は核にコードされています。 > ＞ミトコンドリアと細胞質の比較もしております。細胞質にはほとんど発現は認められません。 > > このことも含めて考えると、 > UTRをいじるのはあんまり劇的に変わるものじゃないと「想像」するのは私だけでしょうか。 pさんの至適、もっともかと思います。しかし、実験上、少なくともノックダウンした細胞に元々の内在性蛋白質の量と同じくらいの発現量を回復させたいところなのですが、それができず、停まってしまっているので、色々なご経験をされている方に、意見を伺いたいというのが、このトピの願いです。 もし、何かありましたら、またレスいただけるとありがたいです。 文字だけのコミュニケーションなので、なかなか、意を伝えるのが難しいのですが、よろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.1480-18 - 2009/11/05 (木) 23:32:32 - 教えて下さい。 ミトコンドリアとか全然素人なんで勉強のために教えて下さい。この蛋白質はもともと核ゲノムにコードされているものなのでしょうか。それともミトコンドリアゲノムにコードされているのでしょうか。後者の場合、全て転写から蛋白質合成までミトコンドリア内で（一度も細胞質に出ることなく）完了すると考えてよいですか。リボゾームとかRNA ポリメラーゼとか一応最低限必要な道具はミトコンドリア内に一通りそろっているように習ったのですがそうなんでしょうか。あとそういうミトコンドリアDNAにコードされた遺伝子を外から入れて蛋白質を発現させるのはやっぱり難しいのでしょうか。ミトコンドリア蛋白質とかはなんか複合体と作っているのが多いような印象があるのですが、サブユニットとか一つだけ量が増えても、他のパートナーの量が変わらなければ、複合体からあぶれたものばかり増えるだけでそういうのは相手がいないから不安定で結局分解されてしまうような感じもするのですがそういうことはないのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.1480-17 - 2009/11/05 (木) 19:50:08 - 千夏 実は私も「発現量が少なく（内在の10分の1未満）」というのには興味があります。というか、少なくとも私はこれをみて、「発現してないだけじゃない？」と思いましたｗ mRNA levelでの発現を確認したかどうか？ yesならlysosomal inhibitorやproteasome inhibitorレスキューされるかどうか？　それは核DNAにコードされているのか、mtDNAにコードされているのかどうかってところでしょか。vectorを新しいのに入れ替えるのもよくきくおまじないなので、やってみては？？ あるタンパク質を想定していうのであれば、pさんの推察通り細胞が死んでいるんでしょぅ。apoptosisの阻害剤でどうか。またmitophagyが誘導されている可能性もありますよねー。膜電位かミトコンの分裂融合関連ならば！

(無題) 削除/引用 No.1480-16 - 2009/11/05 (木) 18:59:43 - ？ ここは自分の考えと違うものを否定するところですか？ ならば、この書き込みも駄目かもしれませんが、よくわからないところだあるので、 ちなみにあべちゃんがどういう書き込みをしていたかなんてよく知らない者です。 ＞タグ付き、タグ無し、で発現させ、タグに対する抗体、目的蛋白質に対する抗体でウエスタンしました。が、やはり、10分の1未満です。 どうやって10分の1未満確認したのかちょっと興味があります。

(無題) 削除/引用 No.1480-15 - 2009/11/05 (木) 18:51:25 - p 新参者はお呼びでないようですね。 すみません。

(無題) 削除/引用 No.1480-14 - 2009/11/05 (木) 18:26:56 - in situ >これらのことから考えられるのは、 >mRNAがミトコンドリアに局在して、翻訳の場がミトコンドリアということでしょうか？ 自分が書いたのはそういうことです。 mRNAが細胞内小器官にターゲッティングされ、そこにリボソームがやってきて翻訳されるという機構が最近分かってきていると認識しています。 >想像と妄想は違うと思うだけです。単に１つの可能性だけについて >どうか、と言われたのに対しての書き込みをしただけであるのに >そう書かれるのはちょっと。 確かに、細胞が死んでいるというのも一つの可能性です。 が、あべちゃんさんのその他の書き込み、および普段の書き込みのレベルからしてそこをチェックしていないのはあり得ないと思いましたし（それこそウエスタンのときにインターナルコントロールとれば済む話ですし）、それでなおかつ発現せず苦労しているということは、通常のタンパク発現では考えないような要素も考慮する必要があるかなと思ってそういう可能性を書きました。

(無題) 削除/引用 No.1480-13 - 2009/11/05 (木) 17:37:19 - p 私がまるで想像することをダメと言っているように思われていて さらにそんな私がダメであるような言い方に取れる書き込みがありますが、 想像と妄想は違うと思うだけです。単に１つの可能性だけについて どうか、と言われたのに対しての書き込みをしただけであるのに そう書かれるのはちょっと。 私にはわからないのですが、 > 5'、3'のnoncoding regionがmRNAのターゲッティングに重要であり、mRNAのターゲッティングがタンパク質の発現部位に影響を与えるというのを読んだことがあります。 > その論文ではbasal、apicalの局在を論じていましたが、ミトコンドリアでもそういうのがあるとしたら、ORFだけでなく前後の領域もクローニングしたら発現にも影響を与えるのでは？と。 これらのことから考えられるのは、 mRNAがミトコンドリアに局在して、翻訳の場がミトコンドリアということでしょうか？ それだと、もともとミトコンドリアで翻訳されないmRNAだとしたら、 コドンがどうとか面倒なことになるのでは？ ＞ミトコンドリアと細胞質の比較もしております。細胞質にはほとんど発現は認められません。 このことも含めて考えると、 UTRをいじるのはあんまり劇的に変わるものじゃないと「想像」するのは私だけでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.1480-12 - 2009/11/05 (木) 16:21:23 - あべちゃん >[Re:11] in situさんは書きました : > でも、見た感じそれほど長い領域ではないので（ヒットしたのは250nt程度でした）前後500nt程度つければ大丈夫では…とも思ったり。 in situさん、 ありがとうございます。 既知の物から攻めていくのが良いですよね。自分でも、きっちり調べて、UTRの可能性を詰めていこうと思います。

(無題) 削除/引用 No.1480-11 - 2009/11/05 (木) 16:17:33 - in situ 今ざっと論文を調べてみたところ、すでにmRNAのmitchondria targetingに必要だと思われるUTRの領域が分かっているタンパク質もあるようなので、それをキメラUTRとしてつけてしまうというのも手かと思われます。 でも、見た感じそれほど長い領域ではないので（ヒットしたのは250nt程度でした）前後500nt程度つければ大丈夫では…とも思ったり。

(無題) 削除/引用 No.1480-10 - 2009/11/05 (木) 15:43:57 - あべちゃん >[Re:7] in situさんは書きました : > 自分ごときがこういったテーマにコメントしていいのかどうかわからないのですが、一応思いついたことがあるので書かせていただきます。 in situさん、 いえいえ、とても感謝してます。ありがとうございます。 > 5'、3'のnoncoding regionがmRNAのターゲッティングに重要であり、mRNAのターゲッティングがタンパク質の発現部位に影響を与えるというのを読んだことがあります。 > その論文ではbasal、apicalの局在を論じていましたが、ミトコンドリアでもそういうのがあるとしたら、ORFだけでなく前後の領域もクローニングしたら発現にも影響を与えるのでは？と。 > > いかがでしょうか？ やはりそうですよね。私もその可能性の重要さを感じてます。 この方針で進めるに当たって、難しいと思うのは、何処まで領域を含めるかだと思います。機能領域が何処まであるのかわかりませんし。全部入れようとすると、サイズがかくって、気後れしていましたが、おおさんやin situさんのご意見を伺って、やっぱり避けて通れないなぁと思っているところです。

(無題) 削除/引用 No.1480-9 - 2009/11/05 (木) 15:40:20 - あべちゃん >[Re:6] pさんは書きました : > 可能性はわかりません。 > > 結局、150は発現しそうというは人の勝手な想像であって > それを予想することはあまり意味がないのではと思います。 > > pさん、レスありがとうございます。 想像することをやめてしまったら、研究ってつまんないですよね。 想像されることと違う現象が見つかったら、なぜなんだろう？と、あれこれ考えるの醍醐味だと思うんですが、人それぞれということで。

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