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トランスフェクション後の細胞の変化 トピック削除
No.1475-TOPIC - 2009/11/03 (火) 20:58:51 - student
哺乳類細胞に外来遺伝子を導入しクローニング後に、免染、封入後に鏡検しました。
そうしたら核が各コロニーで大きさが変化した像が見えたんです。
ボスが「導入した変化だろう」と言ったのですが自分には封入時のアーティファクトにしか見えません
pubmedで検索しても増殖速度が変わったと言った話は目にしますが、そういう核の変化に対する報告は目にしません。
どなたかお勧めの参考文献や意見がありましたらぜひお願いします
　
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(無題) 削除/引用
No.1475-8 - 2009/11/05 (木) 11:45:39 - ~
>[Re:7] ~は書きました :
> 染色体にインテグレートされないと見られない現象かもしれませんので、

これは考えにくいですね。
ただ、手持ちのクローン化された細胞のほうが、結果はきれいに見えると思います。

(無題) 削除/引用
No.1475-7 - 2009/11/04 (水) 09:53:45 - ~
生細胞に取り込まれるヘキストはHoechst 33342ですね。

昔とある遺伝子を入れた細胞で核の肥大が見られたことがあります。
クロマチンの凝集、脱凝集に関連する遺伝子だったので意味はあると思っていましたが、
コメントして追加実験を求められると修了に間に合わなくなるので触れずに投稿しました。

その核の大きさは免染で見ている目的たんぱく質の発現量とは関係がありそうでしょうか？
また、染色体のアッセンブルなどに関係しそうな遺伝子なのでしょうか？

まずは、ヘキスト＋免染などで、発現量とサイズに相関が見られるのかを見てみてはいかがでしょうか。
トランジェントで見るのもいいですが、染色体にインテグレートされないと見られない現象かもしれませんので、手持ちのstableなクローンを複数見てみるのが先のような気がします。

(無題) 削除/引用
No.1475-6 - 2009/11/04 (水) 03:48:15 - おお
膜透過せいの核染色よう蛍光ダイをつかえば、
生きた細胞で核がはっきりと染色できますので、
(ヘキストとかで番号は覚えてないですが、、、)
核の大きさを測定しやすいとおもいます。
で固定や封入といったステップでのアーティファクト
をみているか判断しやすいと思います。

質問者さまはこの手の解析に不慣れのように思えますので、
どの様に数値化するといいか(特異的な核をもつ細胞が
なん%あるとか、顕微鏡で測定したときの核の占める面積
のディストリビューションとか)１度考えて見ると
いいかと思います。

(無題) 削除/引用
No.1475-5 - 2009/11/04 (水) 01:19:33 - あべちゃん
>[Re:3] studentさんは書きました :
> 封入時のartifactと考えた理由は？
> やはり報告を目にしないからです

論文にないからこそ、おもしろそうだと感じるのですが、それ以前にご指摘があるように、コントロールとの比較とか大事ですね。

ボスがartifactだといっている理由とかも気になります。

(無題) 削除/引用
No.1475-4 - 2009/11/03 (火) 22:28:05 - み
>[Re:3] studentさんは書きました :
> Empty vectorのクローンでは？
> いえ、CMVプロモーターが挿入されています
そういう意味じゃなくて・・・control vectorを入れたstableとも比較しているのか？ということ


> transientでは？
> いえ、今回観察した検体はすべてstableです
そういう意味じゃなくて・・・transientでも同じ現象は観察されるのか？

(無題) 削除/引用
No.1475-3 - 2009/11/03 (火) 22:09:13 - student
>複数のクローンでそうなのか？
あったりなかったりで非特異的感があります

何回やってもそうなのか？
一度しかまだ封入していません

Empty vectorのクローンでは？
いえ、CMVプロモーターが挿入されています

transientでは？
いえ、今回観察した検体はすべてstableです

封入時のartifactと考えた理由は？
やはり報告を目にしないからです

確かに、核の形態の変化した細胞をもう一度鏡検すればはっきりしますね。２、３、回やってみて同じようならもう一度かんがえてみます。

アドバイスありがとうございます。

(無題) 削除/引用
No.1475-2 - 2009/11/03 (火) 21:28:28 - み
複数のクローンでそうなのか？
何回やってもそうなのか？
Empty vectorのクローンでは？
transientでは？

封入時のartifactと考えた理由は？

事実なら既存論文にないから面白いのでは？

トランスフェクション後の細胞の変化 削除/引用
No.1475-1 - 2009/11/03 (火) 20:58:51 - student
哺乳類細胞に外来遺伝子を導入しクローニング後に、免染、封入後に鏡検しました。
そうしたら核が各コロニーで大きさが変化した像が見えたんです。
ボスが「導入した変化だろう」と言ったのですが自分には封入時のアーティファクトにしか見えません
pubmedで検索しても増殖速度が変わったと言った話は目にしますが、そういう核の変化に対する報告は目にしません。
どなたかお勧めの参考文献や意見がありましたらぜひお願いします
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