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(無題) 削除/引用 No.1466-7 - 2009/11/06 (金) 17:57:37 - ＾＾ 発現効率が低く､ウェスタンの検出感度に達していないだけだと思います。 膜タンパクの一過的発現なら無理もないかと･･･

(無題) 削除/引用 No.1466-6 - 2009/11/06 (金) 01:59:03 - おお >[Re:5] Tomさんは書きました : > 皆様、ご指摘ありがとうございます。 > > COS7におけるGFPの発現は、顕微鏡下で観察したのみですが、ほとんどの細胞にGFPが導入されていました。 GFPではトランスフェクションの効率は問題ないということですよね。 こんなことも考えられます。もし、共発現で発現をチェックしているなら、 プロモーターのコンペティッションで目的のタンパクの発現が抑えられているかもしれません ので、トランスフェクションがあんていしているなら、 同じ条件でGFP抜きで改善が見られるかもしれません。

お礼 削除/引用 No.1466-5 - 2009/11/05 (木) 21:10:02 - Tom 皆様、ご指摘ありがとうございます。 COS7におけるGFPの発現は、顕微鏡下で観察したのみですが、ほとんどの細胞にGFPが導入されていました。 また、教えていただいた論文で同系のpcDNA3ベクターでVEGFR2が発現していることが報告されていました。 導入効率やベクターには問題なさそうですので、全長cDNAのインサートをコーディング領域だけにして再度ベクターに入れてみます。

(無題) 削除/引用 No.1466-4 - 2009/11/04 (水) 11:45:35 - おお >[Re:3] ~さんは書きました : > 問題があるとすれば、関連する論文を検索している気配がしない点でしょうか。 私もひそかにそう思っていました。。。。。

(無題) 削除/引用 No.1466-3 - 2009/11/04 (水) 11:06:34 - ~ 問題があるとすれば、関連する論文を検索している気配がしない点でしょうか。 貴方が新規にクローニングした遺伝子で無い限りは、同じ操作をしている論文を探すのが始めの1歩だと思います。 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2574836/ Cos-7にVEFGR2をトランスフェクションしている論文はありますよね。 "VEGFR2-GFP"などで検索すれば、タグ付きですが多くはトランスフェクションした遺伝子を用いた論文がヒットします。 （ノックインかもしれませんが） それらの文献の情報が参考になるのではないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.1466-2 - 2009/11/04 (水) 09:55:41 - おお >[Re:1] Tomさんは書きました : > VEGFR2配列のサイズ(約4.2kb)がpcDNA3.1ベクターのサイズ(約5.4kb)とかわらないので、発現効率が悪いのではないかと考えています。 ベクターのサイズとインサートのサイズの比較で持って 発現が弱いとか強いとか想像できるものではないと思いますが、、、、 インサートを入れた時のATGの上流があまりよくない可能せい があるかもしれません。インサートはコーディングリージョン だけでしょうか? 違うベクターということであればpCIとか、スプライシング サイトを含むようなのがものがいいかもしれません。 COSとかだとウエスタンで検出できるくらいは発現しそうな きがしますけどね、、、、、 トランスフェクションの効率はGFPとかで見積もってますか?

VEGFR2配列の発現ベクターへの組み込み 削除/引用 No.1466-1 - 2009/11/02 (月) 20:07:53 - Tom VEGFR2配列をpcDNA3.1ベクターに組み込み、Lipofectamin2000試薬でHela細胞やCOS7細胞に導入しました。トランスフェクション24時間後にサンプルを調製し、ウエスタン解析したところ、どちらもVEGFR2の発現を確認できませんでした。 VEGFR2配列のサイズ(約4.2kb)がpcDNA3.1ベクターのサイズ(約5.4kb)とかわらないので、発現効率が悪いのではないかと考えています。 どのようなベクターに導入したらよいのか？または、何か別に問題があるのかアドバイスしていただけると幸いです。よろしくお願いいたします。 VEGFR2の発現において、以下のことには問題がないと考えています。 １．トランスフェクション試薬 同じ試薬で、他のタンパク質の配列をもつベクターの導入およびタンパク質の発現を確認しています。 ２．VEGFR2の配列 VEGFR2の配列は自作したものとフナコシから購入したものを用いていますが、どちらも配列を確認しています。自作は全配列を確認しています。フナコシのものは、配列保証のものです。 ３．VEGFR2配列のベクターへの挿入方向 ベクターに組み込んだ後、配列を確認しています。 ４．VEGFR2抗体 HUVEC(ヒト臍帯静脈内皮細胞)でVEGFR2を検出することを確認しています。

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