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(無題) 削除/引用 No.1464-9 - 2010/09/17 (金) 05:19:14 - 通りすがり 　ずばり、温度が低すぎるときの典型的な症状です。もう少し温度を上げてください。切片が３０umのように厚いときは、温度を高くして組織に弾性を持たせるのが一般的です。

(無題) 削除/引用 No.1464-8 - 2010/09/14 (火) 12:35:47 - wee 確実な事はわかりませんが、ブレードが欠けているとそのような切片のひび割れが起こることがあります。ブレードを新しくしてはいかがでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.1464-7 - 2009/11/04 (水) 08:25:52 - CJ もし切れる音が大きい時は試料が硬すぎる証拠です。温度が低すぎます。 −80度で凍らせる場合はままあります。低温から温度を上げるのには驚くほど時間がかかります。 このような場合、切る直前にブロックを軽く親指の腹で温めてあげてください。

(無題) 削除/引用 No.1464-6 - 2009/11/03 (火) 10:23:38 - 組織 プロトコールには特に大きな問題はなさそうですね。切片も30 umと厚いし、切りやすそうなんですけどね。書き込みを見る限りだと、サンプルが硬くてパサパサしているような感じでしょうか。以下、思いついた点をあげてみます。 他の方からも指摘がありますが、刃は新しいものに変えてみましたか？それと刃の材質はカーボンでしょうか、ステンレスでしょうか？凍結切片の場合はカーボンの方が切りやすいと思います。 凍結ブロックは密封して保存してますか？密封せずに長く保存していると、ブロックが凍結乾燥してパサパサになり、切りにくくなります。 ラット脳なので問題ないとは思いますが、サンプルが大きすぎませんか？あまり大きすぎると切りにくいので、正中で半割した方がいいかもしれません。 うまく切れるサンプルと駄目なサンプルに、なにか特徴は見つけられませんか？（週齢、脳の大きさ、サンプリング時期など） とりあえず対応策として、思い切って（サンプルが融けない程度に）庫内の温度を上げてみてはどうでしょうか？少し切りやすくなると思います。

(無題) 削除/引用 No.1464-5 - 2009/11/03 (火) 10:06:31 - Eire マウス脳の凍結浮遊切片は時々作製しています。 浮遊切片なら30マイクロメーターというのはまあ、普通ですよね。 私は20−40マイクロメーターの範囲で切っています。 また、浮遊切片だと固定は必須ですね。 お尋ねの件ですが、症状からすると単にクライオスタットの刃が古いとかという問題ではなさそうですね。確かに、刃が古いと切片にスジが入ったりしますけど、切った端からぼろぼろになったりすることはないと思うので。 クライオスタットの庫内温度が低すぎるのかな、という印象を持ちました。そのせいでサンプルブロックが乾燥しすぎてぽろぽろ破れてしまうのでは。100% OCT コンパウンドに包埋した脳であれば、クライオスタットの状態にもよりますがマイナス15度くらいで切った方が良いときもあります。あるいは、庫内温度とサンプルを固定するステージの温度を別々に設定できる機種であれば、ステージの温度を若干高めに設定すると良いかもしれません。 あと、これは以前のトピック (No. 1397) (http://www.kenkyuu.net/cgi-biotech/biotechforum.cgi?mode=view;Code=1397) で紹介されて知り、私自身試してみて非常に良い結果が得られたので、今では常用している方法があります。それは、包埋に OCT コンパウンドと 20% スクロース/PBS を 2:1 の比で混合したものを使うことです。 100% OCT コンパウンドよりも液がゆるいので初めは戸惑うかもしれませんが、ブロックがしっとりして非常に綺麗な切片を容易に作製できます。浮遊切片としてももちろん使えます。上に挙げたトピックにもありますが、この場合はクライオスタットの庫内温度を幾分低めに設定して切っています。 では、お役に立てば幸いです。

(無題) 削除/引用 No.1464-4 - 2009/11/02 (月) 22:14:51 - う まず、組織によって固定後の硬さ、最適温度などは異なるので 脊髄で切れるからというのは比較の対象にはなりません。 ＞、アコーディオンの蛇腹（じゃばら）の様 これはクライオスタットの刃の切れ味が悪いからと思われます。 それか組織が硬すぎるか。 ＞うまく出来るときは、非常にうまく薄切片を作成できます。 このことからも、刃の切れ味が悪いか、もしくは 固定とかの条件が同じといっても、組織の切り方、大きさ、状態 それらによってサンプルの具合が変わり硬さなどが異なることもある。 思いあたるところがあれば、それも含めて条件を一定するか、 腕をあげるか。 あと、よく「切れない」と言ってくる人がいるが、どのくらい切ったのか疑問に思うこともあります。 ちょっとは練習しないと、それはうまくできないよ、と。 条件云々よりも、腕ということもあり得ます。 サンプルがもったいないのなら、正常な脳で練習するくらいの気概でやってみてはいかがでしょうか。

厚すぎるのかも．．． 削除/引用 No.1464-3 - 2009/11/02 (月) 20:49:54 - ユキ バラバラになるのは厚さが関係しているのでは？ 30μmは少し厚い気がします（意図がある？）私は通常は5μm前後，マイクロダイセクションの場合でも10μm程度で複数枚切るようにしています．あと，組織によって適温が異なりますので，チャンバー内の温度を変えたりすることもあります．バラバラになる時は温度が少し低すぎるかも知れません．その他に，上手く切れないときは刃角や台座の緩みがないかを確認しますね．上手く切れるまで切り進めずに一度仕切りなおすのが良いと思います．

(無題) 削除/引用 No.1464-2 - 2009/11/02 (月) 19:04:53 - よっしー マウスでしか経験がありませんが，思いついたことをいくつか． 凍結切片をつくる場合は固定はしない．(してる人もいるようですが，私は極力しない) 設定温度が低すぎる，あるいは組織が大きいので中の温度が設定温度まで上がっていない． 薄切片で30マイクロというのは切った事がないのでよくわかりませんが，その辺が，何かからんでいるのかな？ あまり参考になりませんね．

クライオでの薄切片作成中の割れ、破け 削除/引用 No.1464-1 - 2009/11/02 (月) 18:25:31 - rat脳 はじめまして。 現在、ラット脳サンプルを使用しまして、免疫染色法を実施しようとしているのですが、問題がありまして、ご教授お願いしたく書き込みました。 一般的なOCTコンパウンド包埋サンプルの作り方を施し、 　（ラット病態モデルを作成） 　　　↓ 　（PBS bufferで脱血、4% PFAにて固定） 　　　↓ 　（全脳組織を取り出し、4% PFAにてo/nでポスト固定） 　　　↓ 　（20 % スクロース(/PBS Buffer)にて置換（組織が沈むまで、約2日程度）） 　　　↓ 　（スクロースを軽く拭きとり、OCTコンパウンドに漬け） 　　　↓ 　（ドライアイスにて急冷、-80℃で保存） クライオスタットにて薄切片作成 　（クライオスタット（-20℃設定）に約30分程度慣らし） 　　　↓ 　（30 umの薄切片を切り出す） 　　　↓ 　（PBSに漬け、フローティング法にてIHC） という、プロトコールで行っています。 問題といいますのは、クライオスタットにて薄切片を切り出す際に、クライオスタットの刃と並行にサンプルがボロボロに裂けてしまうことです。 スライスを行っている最中から、既に破れているなと感じます。 裂けたところは欠落してしまって観察できません。 ひどい時には、すだれ状と言いますか、アコーディオンの蛇腹（じゃばら）の様にPBS Buffer内で広がっていく感じになります。 常になる訳ではなく、しかし、その原因も分かっていません。 （うまく出来るときは、非常にうまく薄切片を作成できます。また、脊髄サンプルではこういった事態は経験していません。（脊髄の場合はポスト固定を4時間、スクロース置換をo/nでやっているのですが。） 原因が分からないことには、サンプルがもったいなくて仕方ありません。 原因など、ご教授お願いします。

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