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(無題) 削除/引用 No.1462-8 - 2009/12/25 (金) 09:34:44 - みみ NotIは末端での切断効率が悪いです。PCR産物をダイレクトに制限酵素処理するよりも，一回TAクローニングか何かで他のクローニングベクターに入れてから，改めてBamHI，NotIで切り出す方が早いときがあります。 末端の切断効率についてはNEBのカタログが参考になるかも。

FlHMUciC 削除/引用 No.1462-7 - 2009/12/24 (木) 18:36:45 - headline1

TSさんありがとうございます 削除/引用 No.1462-6 - 2009/11/02 (月) 18:37:58 - かるべ TSさんありがとうございます おっしゃられる通り、プレイマーと増幅領域の塩基配列が完全に一致していないと増幅できないのでは？ という不安がありました。 ~ さんの書かれているように、 ベクター1のインサートをBamHI、NotIで切断し、切り出す。 ベクター2をBamHI、NotIで切断し、切り出す。 インサートとベクター2をライゲーションし、当たりを取る。 を行いたいのですが、まず、ベクター１の目的部位をPCRで増やして、制限酵素でカットして、ベクター２にライげーションすればいいのかと思い質問しました。 その時の、ベクター１の目的部位をPCRで増幅する時のプライマーで困ってしまいました。 あまりにも初歩的なことなので、近くにできる人がいればよかったのですが、見当たらなかったので質問いたしました。 プライマー設計ソフト（フリー）を使ってプライマーを作ってみたのですが、right primer はBamH1を含んだプライマーなのでそのままオーダーしようと思ったのですが、leftプライマーには、制限酵素サイト部位が含まれていないので、それを参考に、そこに制限酵素サイトと何塩基化たしたもので、Tm値等を考えて作成し直せばいいのか、どうすればいいのか、わからなくなってしまい質問いたしました。 プライマー＋Not1＋３〜５塩基で試してみます。 ありがとうございました。

ありがとうございます 削除/引用 No.1462-5 - 2009/11/02 (月) 18:14:23 - かるべ ありがとうございます 言われる通り、 ベクター1のインサートをBamHI、NotIで切断し、切り出す。 ベクター2をBamHI、NotIで切断し、切り出す。 インサートとベクター2をライゲーションし、当たりを取る。 を行いたいのですが、インサートにNot1サイトがなかったので どうしたらいいのかわからず質問いたしました。 TSさんが書かれている通り プレイマーと増幅領域の塩基配列が完全に一致していないと増幅できない と思っていました。 ご教授、ありがとうがざいます

(無題) 削除/引用 No.1462-4 - 2009/11/02 (月) 18:01:30 - う http://www.shujunsha.co.jp/book/4-87962-/182-X.html 基本はしっかり勉強した方がいいのでは？ 巷には便利で簡単な本があふれています。 それを利用しない手はないと思いますが。

(無題) 削除/引用 No.1462-3 - 2009/11/02 (月) 17:46:51 - TS 私が間違った解釈をしていなければですが。 ＞left primerにはNot1サイトがないためどうしたらよろしいでしょうか。 Left primer にNot1サイトを付加したものを作成して、PCRすればよいでしょう。 かるべさんは、プレイマーと増幅領域の塩基配列が完全に一致していないと増幅できないと考えているのではないでしょうか？ プライマーがアニーリングするとき、Not1サイトがぶらぶらしていても増幅はかかります。 目的配列は、Cohesive endに最終的にされますが、リーディングフレームのこと、Not1,BamH1で消化するためのおまけ塩基付加に気をつけてプライマーを設計すると良いでしょう。 このあたり、教科書に載っていますよ。

(無題) 削除/引用 No.1462-2 - 2009/11/02 (月) 16:59:52 - ~ 何をしたいのかがよく分からないのですが。 ベクター1のインサートをBamHI、NotIで切断し、切り出す。 ベクター2をBamHI、NotIで切断し、切り出す。 インサートとベクター2をライゲーションし、当たりを取る。 という操作をしたいのだと思いますが、 そのプライマーは何のために使う予定なのですか？ ベクター2にインサートが入ったものをコロニーPCRなどであたりをとりたいのであれば、制限酵素サイトは必要ありません。 ベクター2のMCSよりも、フォワード・リバースそれぞれ5'側にプライマーを設計すればいいでしょう。

プライマーの設計のことで 削除/引用 No.1462-1 - 2009/11/02 (月) 15:40:06 - かるべ PCR操作が初めてですので、とても初歩的な質問ですが、 ご教授おねがいいたします。 現在、あるベクター１．から別のベクター２．に目的遺伝子を切り貼りする実験行おうと思っています。 ベクター１．2種類の制限酵素で処理して、同じ制限酵素で処理したベクター２．はめ込もうと考えています。 認識サイトはNot1とBamH1で行おうと思います。 ベクター１．のMCSは目的物の後ろにあるため、目的物をPCRする時、right primer はMCSにある、BamH1を含んだプライマーを設計しようと思うのですが、left primerにはNot1サイトがないためどうしたらよろしいでしょうか。 目的物の初めにNot1サイトを付加する方法はございますでしょうか。 このような場合、TAクローニングを行うほうがいいのでしょうか。 大変初歩的な質問になりますが、よろしくお願いいたします。

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