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(無題) 削除/引用 No.1457-9 - 2009/11/02 (月) 22:21:04 - お ラボの先輩と指導者の意見 自分が楽できそうな意見の方を 個人的には大丈夫だと思うとか言って ラボの先輩の意見だけを取り入れるようなこと これからもしちゃいかんよ。

(無題) 削除/引用 No.1457-8 - 2009/11/01 (日) 22:31:07 - 修士課程 皆様、多くのご回答ありがとうございました。 リプローブして検出したい蛋白はリプローブ前に検出した蛋白と位置が近く、一次抗体の由来種も同じです。 ラボの先輩はリプローブで妙な結果に遭遇したことは無いと言っているので、個人的には大丈夫なんじゃないかと思っているのですが・・・、こればかりは指導者に従う、というか相談するしかありません。もちろん（こっそり）やるとしても、「予備的」な結果にとどめておこうと思います。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.1457-7 - 2009/11/01 (日) 22:19:39 - p もし検出される目的タンパク質同士の分子量が異なるのであれば、転写後のメンブレンをカットしてウエスタンしても良いんじゃ無いかと思いますが、どうでしょう。

(無題) 削除/引用 No.1457-6 - 2009/11/01 (日) 21:35:12 - c もしも見たいタンパク質の分子量がそれぞれ違うならば異なる抗体を同時に使って免疫反応させればどうでしょうか。この場合あらかじめ、１サンプル分だけでいいので、それぞれの抗体が本来の分子量以外のところに紛らわしいシグナルが出ないこと（もし出るならばその場所を特定しておくこと）を確認する予備実験をしておいた方がいいと思いますが。ローディングコントロールのアクチンとかの抗体と、調べたい蛋白質の抗体を同時に使って一枚のブロット上で示している論文は以前に何回か見たことあります。でも最大でも３つ同時が限界かと。４つ以上の抗体で同時とかは訳が分からなくなる恐れが大なのでしない方がいいとおもいますが。自分で一度予備実験してみていけそうならば、そのデータをみせながら指導している人とよく相談してお互いにうまく妥協点をみつけて下さい。通常、ブロットされた蛋白質は非常に強固に膜に結合しているものが多いですが、蛋白質の性質は多様ですからもちろん例外もあるとは思うし、指導してる人は、もしかするとそういう蛋白質に遭遇した経験があるのかもしれないですね。ウェスタンの場合、定量的に見たいというときは再現性も考えると、他の人も書いているように、目で見てわかるレベルでないと安定したデータを得るのは現実にはたいへん難しいです。

(無題) 削除/引用 No.1457-5 - 2009/11/01 (日) 20:54:30 - ？ この質問に対して、 定量性がどうこう質問者に言ってもしょうがないでしょう。 指導者がそう言っているんだから。 質問者の言い分だけでは指導者がほかにどう言っているのかもわかんないだし。

(無題) 削除/引用 No.1457-4 - 2009/11/01 (日) 20:50:24 - 懐疑家 そもそもウエスタンで定量しようと思ったら、同じゲル、同じメンブレン上にポジコンを量を振って置いて、それでキャリブレーションする必要がありますよ。たとえリプローブしないからと言って、そのままデンシトメーターに掛けて定量性云々などと主張するのは論外です。

(無題) 削除/引用 No.1457-3 - 2009/11/01 (日) 20:36:46 - う >、バンドの定性性はあっても定量性が損なわれると言うことを指導者から言われました。 まず、質問者さんは、指導者から言われたことを無視して ここでされる回答によっては ＞できれば3-4回リプローブして使いまわしたいところです これを実行するつもりでしょうか？ 勘違いしてはだめです。 あなたが行っている実験は、指導者と方針を決めて行う実験です。 それをここで聞いてどうするというレベルの話ではありません。 指導者は、定量性が損なわれると思うのでこの実験ではリプローブしない と方針を決めているのです。 それに対して、他人がどうこう言うものではないし、質問することでもありあません。 そう決まったのなら、実験を楽しようと思わず、 lysateを用意すればいいのです。 手持ちのもので終わらせたいって思っているのが見え見えです。 それをしたいのであれば、指導者と話し合いなさい。

(無題) 削除/引用 No.1457-2 - 2009/11/01 (日) 14:44:24 - み とりあえずreprobeで予備的に検出しておいたら良いでしょう。 lysateが限られると言っても、再度新たなlysateを調製して再現性を見るのでしょ。最低3回はね。 たった1回の実験でたとえその時、何対かの比較をしていたとしても、異なる日に調製して同様の結果が出ないと・・・。 再現性あるなら、reprobeでも定量しても良いでしょう。internal control dataも取っておられるのでしょうし。 reviewerによっては確かに定量しろと言うけど、僕はいつもデンシトで数値化しないと差がはっきりしないデータなのかよ？？？ってむしろ思う。 一目瞭然の差を出したいものです。 またウェスタンのデータだけで論文にするわけじゃないのでしょうし、その他の実験結果とどのように関連しているのかを併せて考えれば、reprobeであろうが「実験データとしては間違いない」と判断できるならそれでいいでしょ。

リプローブ後のバンドの信頼性 削除/引用 No.1457-1 - 2009/11/01 (日) 12:51:47 - 修士課程 よろしくお願いします。 ウェスタンで、リプローブしたメンブレン(PVDF)を使って再ブロットすると、バンドの定性性はあっても定量性が損なわれると言うことを指導者から言われました。しかし、手持ちのlysate量が限られており、できれば3-4回リプローブして使いまわしたいところです。定量が必要な蛋白を検出するためには、SDS-PAGEからやり直すべきなのでしょうか・・・。 教えて頂けるとありがたいです。 よろしくお願いします。

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