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(無題) 削除/引用 No.1445-14 - 2009/12/10 (木) 11:19:23 - CJ 私は細胞ではなく、組織を調べているので、条件の違いは大きいですが、 固定時間が短いのではないか？：ＩＳＨではかなり強い固定が有効です。１晩以上固定してみては？ ＮＢＴの発色は私の場合、３７℃で３−５ｈです。 なお、ＡＰはにじむので局在性が良くない、っていいますね（だから普通の免疫染色でＡＰでなく、ＨＲＰを使うのです）。ＲＮＡの細胞内局在を見たいのなら、ＨＲＰとＴＳＡを組み合わせた蛍光法をご考慮されてはいかがでしょう（実験法としてはよりトリッキーですが）。

条件検討 削除/引用 No.1445-13 - 2009/12/10 (木) 10:29:55 - めい CJ様のおっしゃる通り、条件を検討すればバックもなくきれいなシグナルが出るかもしれないとは考えています。 恐らくまだ条件詰めが甘いのだと思われます。 昔、同じハイブリ液でISHを６０℃のハイブリ液で行った時はバックがまったくなく、細胞内局在もNBT/BCIPできれいに出ました。その時の条件と今の条件を比較すると、固定する時の温度条件、ハイブリ前の脱脂を行うか行わないか、プローブの濃度です。もしかしたら固定する時の温度条件と脱脂が重要ではないかと予想しており、次の時はこの部分で条件をふってみようと考えています。ただ、昔の条件では発色に４−５日要していたので、待ちきれないというのもありますが。。。（笑） 脱脂の作業がそれほど重要であるとは思わずに、このステップを外していたのですが、、、 後、HNPP/Fast Red を使って蛍光で細胞を観察するとゴミとの違いが明確なので、こちらで条件をつめようかと考えていますが、HNPP/Fast Redはかなり蛍光量が高いのでもしかしたら細胞内局在を見るのには適していないのかもしれないとも考えています。もし何か知っておられたら教えてください。

(無題) 削除/引用 No.1445-12 - 2009/12/08 (火) 12:48:40 - CJ 非常に興味深いのは、ハイブリ温度に流儀があることです、 私のプロトコルでは温度は６０−７０℃でやっており、きわめて強いシグナルと、きわめて低いバックグランドを実現しています。 ハイブリ溶液は 50% formamide 5xSSC (pH7) 2% blocking reagent (Roche) 0.1% N-lauroylsarcosine 0.1% SDS という組成です。 ブロッキングや洗剤の違いが大きいのかもしれません。

ありがとうございました、解決です！ 削除/引用 No.1445-11 - 2009/12/08 (火) 11:48:00 - めい AP様、色々とご助言をいただきましてありがとうございました。いろいろな条件検討をしておりましたので時間がかかってしまいました。でも、何とかシグナルが出るようになりました。 まず、ハイブリの温度を４２℃にしました（５０℃でも高かったようです）。ハイブリ液の組成はそのままです。ただ、脱脂のステップをハイブリの前に入れました。これが良かったかどうかは定かではありません。 発色はNBT/BCIPとHNPP/Fast Redの両方を試しました。どちらもシグナルは出ましたが、どちらも発色させすぎたようで、細胞内局在をみることはできませんでしたが、ターゲットセルかそうでないかは十分わかりました。カウンター染色にDAPIやSYTOを使い、ターゲットのセル以外も検出できるようにしました。 一つ明らかな事は、細胞を室温で３０分固定すると、４℃で固定させたときよりも、プローブの浸透性が良いのか、同じ条件でISHをしたらシグナルが強すぎて真っ黒になってしまいました。昔うまくいっていた時はいつも室温で固定していたので、その部分を変えてしまったから、ISHの後の条件が変わってしまったのかもしれません。 これからも精進します。

やってみます 削除/引用 No.1445-10 - 2009/10/30 (金) 22:33:54 - めい ありがとうございます！ 取りあえず、まだサンプルがあるのでハイブリ温度を下げてやってみます。それでだめだったら細胞を取り直すところから始めるので少し時間がかかりそうです。 またご報告します。

(無題) 削除/引用 No.1445-9 - 2009/10/30 (金) 22:20:17 - AP ちなみに私の材料で一般的なのは、50%フォルムアミドだとハイブリ温度は42℃、少々厳しめで45〜48℃、さらに高く設定したい場合は、（おそらく組織がとろけないようにするため）ハイブリバッファーpHを酸性（pH 5くらい）にして50℃、という感じです。

(無題) 削除/引用 No.1445-8 - 2009/10/30 (金) 22:14:21 - AP フォルムアミド入りでですか。 とにかく、バックが高くて困っているというのではなくて、シグナルが全くでないという状況ですので、ストリンジェンシーを下げる、手っ取り早くはハイブリ温度を下げるというのは有効だと思います。 ISHの場合は、メンブレンハイブリと比べるとストリンジェンシーのコントロールが理論どおりとはいかないところがありますが、、、 一般的にハイブリはTmより25〜30℃くらい低い温度でやります。もちろんストリンジェンシーを高くしたいなら、もっと高い温度でTmに近づけますけれど。 で、フォルムアミドはTmを下げる効果があり、たしか、1%フォルムアミドにつき0.7℃（0.6度だったかも？）Tmが下がるといわれています。 仮にフォルムアミド無しでTmが95℃の系だとすると、50%フォルムアミドを加えるとTmは60℃です。Tmぎりぎりかそれ以上の温度でハイブリしていることになり、かなり厳しいと思います（メンブレンだと50%フォルムアミド、65℃くらいあればdeprobeが出来るくらいの条件です）。 ISHはWashでのストリンジェンシーコントロールがほとんど効かないので、ハイブリを厳しめにするのはよくあると思いますが、少々厳しすぎかもしれません。逆に、そのようにTmぎりぎりでハイブリするなら、より長時間のインキュベーションが要求されるかもしれません。

え！高いのですか？ 削除/引用 No.1445-7 - 2009/10/30 (金) 21:23:45 - めい すみません、教えていただくのに、情報不足でした。 ハイブリは 5xSSC 50% formamide 0.1% Tween 20 pH6.0 50µg/mL heparin 500µg/mL yeast RNA でやっています。プローブはcRNAプローブです。このままのハイブリ液でハイブリ温度を下げてみるということでしょうか？実は、ぼろいインキュベーターを使っていて、なかなか温度が一定にならず、６０℃と言ってももしかしたら６２℃くらいでしているかもしれません。また昔一度だけシグナルがでたときは温度が低めだった可能性も十分あります。 保湿箱をPBSだけにしたことがあったのですが、その時はバックが高くなってしまったので、それ以来保湿はハイブリ液と同じものを使っています。 先ほど固定の条件を検討した方が良いのではというアドバイスを受けて調べていたのですが、以前はスライドに細胞を貼付けた後、４％PFAをたっぷりのせて室温で３０分固定していました。これはあまりにも適当かなと思い、氷にさしたファルコンの中で３０分固定することに途中で変えました（この条件でも大丈夫と聞いたので）。しかし、通常４℃であれば一晩固定するものなので、固定が十分ではなかったかもと考えています。可能性はありますか？また細胞を脱水する必要はあるのでしょうか？７０％EtOHで保存した後はPBSで数回洗って0.5% TritonX-100で処理しています。 もう一つ気になっていることがあります。以前は自分でPLLコートしたスライドを使っていましたが、どうも細胞がついたりつかなかったりするので、市販のAPSコートのスライドを使い始めました。しかし、これはRNase freeという商品ではありません。これは使わない方が良いのでしょうか？ ながながと申訳ありません。完全にお手上げだったので、貴殿のアドバイスが神の声のように聞こえます。 宜しくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.1445-6 - 2009/10/30 (金) 20:26:12 - AP 60℃でハイブリとは、ISHにしてはずいぶん高いですね。フォルムアミドを入れない系でしょうか。ISHの場合、温度が高いと、morphologyその他を損なう可能性があります。温度が高すぎて、アニールが起こりにくくなっているのかもしれませんし。50%フォルムアミド入りのハイブリバッファーにして、42-50℃くらいでハイブリしてみたらどでしょうか。 どのようなプローブか（RNA, DNA, oligo...)、バッファー組成やpHはどうなっているか、もうすこし条件がわかればいいと思いますが。 私は、スライドに貼り付けた切片や染色体標本は、パラフィルムを乗せて、水でぬらしたキムタオルと一緒にタッパーに入れてハイブリしてました。フォルムアミド入りのハイブリバッファーのせいか、ほどよく伸びてぴったり密着していましたが。吸湿などでハイブリバッファーの組成を変えないためには、水ではなくてハイブリバッファーで加湿したほうがいいのかもしれません。

ありがとうございます 削除/引用 No.1445-5 - 2009/10/30 (金) 16:18:42 - めい ありがとうございます。来週もう一度やってみます。

(無題) 削除/引用 No.1445-4 - 2009/10/30 (金) 13:31:05 - CJ スライドグラスにカバーグラス（ないし類似品）をかけ、反応容器に水を入れておいて密封すれば蒸発は防げます。 セルソーターを使ったことがないですが、ホールマウントとは固定条件が大幅に違うことは想像できます。シグナルがでない理由で大きなものに固定の良し悪しがあります。その辺で改良はできないですかね？

乾かないのでしょうか？ 削除/引用 No.1445-3 - 2009/10/30 (金) 13:23:20 - めい はい。RNAを検出するISHです。 実は、以前に一度だけ、きれいにシグナルが出たことがあります。その時と同じ条件でやっているつもりなのですが、なかなか再現できないのです。なので、恐らく発現は低いかもしれませんがあると思われます。また、分取する細胞の数が非常に少なく、まだRT-PCRで細胞の遺伝子発現を調べる方法を起ち上げていません。 いつも６０℃でハイブリしているのですが、乾かないのでしょうか？ハイブリシールというスライドガラスに貼付けてプローブを流し込むタイプのものを使っていますが、スライドガラスに粘着のりのようなものが残ってしまい、ごみが付着してしまいます。できれば、ハイブリシールを使わずにパラフィルムを使ってやりたいと思っていますが、一晩のハイブリでも蒸発してしまうことがあります。また、パラフィルムは端が丸まって乾いてしまいます。 宜しくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.1445-2 - 2009/10/30 (金) 13:05:53 - in situ RNAを検出するISHでしょうか？ でしたら、まず分取した細胞で標的のRNAが十分発現しているのかどうかをRT-PCRかrealtime PCRで確認されているでしょうか？ 胚だと高発現のものが見えているだけかもしれません。 低発現の場合、感度を上げるためには、プローブの濃度を低めで長時間hybridizeするとS/N比の向上、感度の上昇が得られます。 自分も42℃で3日間hybridizeを行うことできれいなシグナルを得たことがあります。

細胞のISH-シグナルが出ない 削除/引用 No.1445-1 - 2009/10/30 (金) 12:57:20 - めい セルソーターで分取した細胞をAPSコートしてあるスライドグラスに貼付けてISHをしようと試みています。同じプローブで胚を用いたWISHではきれいにシグナルを得ることができています。 プローブの濃度は３００ng/mlで、DIG antibodyは２０００倍で使用し、４℃で２日間発色させました。細胞がスライドガラスからはがれていないかどうかを確かめる為にSYTO24で細胞全体を染めて観察したところ、細胞はきちんとあったのですが、DIGで発色させたシグナルらしきものが見当たりません。 どの条件を検討するべきかをアドバイスしていただけると嬉しいです。次はプローブの濃度を1µg/mlにしてみようかと考えています。宜しくお願いします。

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