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核酸のTCA沈殿 トピック削除
No.1444-TOPIC - 2009/10/30 (金) 11:24:12 - in situ
いつもお世話になります。

in vitroでポリメラーゼの活性を見るassayを行っています。

施設の関係でRIが使えないので、ビオチン標識したUTPを取り込ませてdot blotで検出しようとしていますが、モノマーの除去をどうしたものか悩んでいます。

モレクロにはRIを使ったdot blotで、ガラスフィルターに吸着させてから5%TCAでwashする方法が載っていますが、今回使用しているメンブレンがBiodyne plusであるため、この方法は使えません。

代わりに、産物をチューブ内でTCA沈殿させてから沈殿を再溶解してdot blotしようと考えていますが、具体的なプロトコールが見つかりませんので、下記の操作で大丈夫かコメントいただけないでしょうか。
もしくは、よりよい方法をご存じの方がいらっしゃったらご教授ください。

on iceで反応液に等量の10%TCAを加え、4℃top speedで遠心
↓
沈殿を70%エタノールでwash
↓
nuclease free waterに溶解
↓
dot blot
　
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(無題) 削除/引用
No.1444-5 - 2009/10/30 (金) 15:15:23 - in situ
APさま


再度返信ありがとうございます。

とくに固定の作業は行っておりません。（Biodyne PlusはUVクロスリンクやベーキングは必要ないとの説明がついていましたので）

あえて考えられるとすると、ブロット後若干操作に手間取っていて、メンブレンが乾いたかも知れません。
ただ、これで不可逆的に結合するとも考えにくいですし、、

sepharoseのカラムは持っていて、実際試そうとも思ったのですが、サンプル数が結構な数なので、ちょっともったいないかなと思い、TCAで何とかしようとした次第です。

とりあえず、今、先程自分で書いたプロトコルでチューブ内TCA沈殿後ブロットしています。（見切り発車です;）
まだ、途中ですが、共沈剤としてyeast tRNAを20ug加えたにも関わらず、あまり沈殿が見られず若干不安です。

結果が思わしくなかったら、APさまのご助言通りsepharoseのカラムで精製しようかと思っています。

(無題) 削除/引用
No.1444-4 - 2009/10/30 (金) 15:00:23 - AP
それはへんですねえ。DIG標識だろうがビオチン標識だろうがヌクレオチドモノマーがつくことはないはずですが。ひょっとすると、ブロット後の固定処理かなにかで不可逆的に結合しているのかもしれません。なにか固定処理をしていますか、どういうタイミングでですか。

RIをよく使っていたときはDE81を使っていましたが。イオン交換性の濾紙であって、塩溶液で洗うとポリヌクレオチドはくっついたまま、モノマーが落ちるんでしたね。洗浄前と後で比較することで取り込み効率も算出できましたし。それに比べるとTCA沈殿はちょっと面倒だし（ハンドリングもそうだし、廃液処理の問題でも）、回収ロスなんかで振れる可能性もあるんで、やんなかったです。手間がかかる分だけ、精度が高いというわけでもないですし。それに、ビオチン標識はTCAに耐えるのかしら？

なんやかやで、TCA沈殿には否定的なんですが。
TCA沈殿をやるくらいなら、sephacrylやsephadexで排除限界ゲルろ過したら、回収率も除去率もほぼ100％なので、わたしならそうします。

(無題) 削除/引用
No.1444-3 - 2009/10/30 (金) 12:57:02 - in situ
APさま

さっそくコメントありがとうございます。

確かに、自分も最初そのように考えて、直接ドットブロットを行ったのですが、ネガコン（ポリメラーゼ-）もばっちり検出されてしまいました。

モレクロにもDE81というフィルターを使うときは0.5Mのリン酸二ナトリウムでwashすれば大丈夫といったことが書いてあるので、大丈夫と思ったのですが。。

ひょっとすると、モノマーというよりはビオチンが非特異的にメンブレンに結合してしまっているのかもしれません。

一応DIGでもやってみるつもりです。

(無題) 削除/引用
No.1444-2 - 2009/10/30 (金) 12:48:16 - AP
ナイロンメンブレンにヌクレオチドモノマーは全くと言っていいほど付かないはずですが。DIG標識のプローブのチェックもやはりナイロンメンブレンにドットブロットして行いますが、特に未反応のモノマーを除く処理はしません。
ブロット、固定して、そのまま（せいぜい塩溶液で洗うくらいで）次の処理へと進んでいけば、その間にモノマーは十分除かれるのでは。一度、モノマーをブロットして、その程度、影響があるかみておくといいですね。

核酸のTCA沈殿 削除/引用
No.1444-1 - 2009/10/30 (金) 11:24:12 - in situ
いつもお世話になります。

in vitroでポリメラーゼの活性を見るassayを行っています。

施設の関係でRIが使えないので、ビオチン標識したUTPを取り込ませてdot blotで検出しようとしていますが、モノマーの除去をどうしたものか悩んでいます。

モレクロにはRIを使ったdot blotで、ガラスフィルターに吸着させてから5%TCAでwashする方法が載っていますが、今回使用しているメンブレンがBiodyne plusであるため、この方法は使えません。

代わりに、産物をチューブ内でTCA沈殿させてから沈殿を再溶解してdot blotしようと考えていますが、具体的なプロトコールが見つかりませんので、下記の操作で大丈夫かコメントいただけないでしょうか。
もしくは、よりよい方法をご存じの方がいらっしゃったらご教授ください。

on iceで反応液に等量の10%TCAを加え、4℃top speedで遠心
↓
沈殿を70%エタノールでwash
↓
nuclease free waterに溶解
↓
dot blot
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