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(無題) 削除/引用 No.1441-9 - 2009/10/31 (土) 01:32:12 - 33 すみません、初めの方の議論を少し読み跳ばしてました。確かに、糖鎖処理をして、400KDaか80kDaかではおかしいですね。 可能性としては、コンドロイチン硫酸以外の糖鎖が結合していて、CSaseABC処理で400kDa、その他を全て処理して80KDaということが考えられますが。 実際の、コアプロテインのペプチド長はどのくらいんなんでしょう?おおさんの言われるように、80KDaは、リコンビナントの様な気がしますが。

(無題) 削除/引用 No.1441-8 - 2009/10/31 (土) 00:41:51 - 糖鎖 ３３様　ご指導ありがとうございます。 糖鎖の有無で1MDからコアプロテインのみの500kDヘ分子量が変化するというのは感覚的に理解できるのですが、100kD以下になるということはあり得るのでしょうか？ 物わかりが悪く申し訳ございません。

CSPGの構造 削除/引用 No.1441-7 - 2009/10/30 (金) 23:47:47 - 33 大きさのことについてですが、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンのバーシカンが>1000kDa、コアプロテインが400-500KDaなので、それほど不思議ではありません。 糖鎖とはいっても、100糖ちかい鎖が40本近く結合していますので、相当変わりますよ。 一度、プロテオグリカンとグリコサミノグリカン（GAG、糖鎖部分）の構造を成書なので見ておくといいですよ。 あと、GAGの長さや数は、ヴァリエションがあるので、組織ごとにかなり差が出ます。

(無題) 削除/引用 No.1441-6 - 2009/10/30 (金) 20:20:17 - 糖鎖 ご丁寧なアドバイス本当にありがとうございます。 ご指摘の通り、プレパレーションも問題かもしれません。 私の研究室ではRIPAバッファーを使っており、意図なく踏襲しておりました。 過去の論文によって様々なのですが、Tris-HCl,NaClのライシスバッファーで溶解後、遠心した上清を糖鎖処理して泳動しているものを参考にしております。 今まで全くシグナルが出ていないので、どこか根本的な段階でミスがあるのかと考え、O/Nトランスファーや５％メタノールは試したことがありませんでした。 可能な改善点は全てトライしてみます。 市販の抗体のサンプルはhumanの動脈や脳からのサンプルであり、やはり不可解です。

(無題) 削除/引用 No.1441-5 - 2009/10/30 (金) 14:36:50 - おお ウエットを使ってるようですね。その利点を最大限にいかして、 O/Nでゆっくりと確実にトランスファーすると移りがよくなるようです。 細かい条件はたしか過去に議論されていたと思います。 私はセミドライ派ですが、400kDaをトランスファーして検出したことは あります。ゲルは5%くらいでしたけど、ちょっと扱いが面倒でした。 同じタンパクを違う研究グループがプレキャストの4%くらいからの グラジエントゲルをつかって検出していました。 私の系ではメタノールはSDS抜きの条件で5%ぐらいまで下げられます。 検出できないと言う事ですが、もともとプレパレーションが違うということは ないでしょうか? あとサイズがドラスティックに違うことを不思議に思っているようですが、 市販の抗体の添付文書はサンプルはなんでしょうか?リコンビナントであれば 納得がいきませんか?

(無題) 削除/引用 No.1441-4 - 2009/10/30 (金) 13:36:31 - 糖鎖 ありがとうございます。 コンドロイチン硫酸が計４０本程度あると予想されていまして、 糖鎖を処理した場合に４００〜５００kDのバンドが検出されています。 糖鎖未処理では５００kD以上の位置にスメアーなバンドが検出されています。 ウエスタンについては、 １　３．６％スタッキングゲルと６％のセパレートゲルで１５０Vで１時間泳動 ２　１０％メタノールのトリスーグリシンバッファーで１００mAで１時間 でニトロセルロースメンブレンにタンク式のシステムでトランスファーしていますが、250kD以上の位置にバンドが検出できたことがありません。 この系では100kD以下のタンパクは検出できておりますが、 周囲に高分子量のウエスタンをやっている人がいないため、 どこが問題か分かりません。 過去ログからCAPSバッファー、PVDFメンブレン等への変更も検討していますが、論文のMethodでは必ずしもこれらのバッファー、メンブレンがクリティカルではないようです。 次はゲル染色を行い、問題が泳動なのかトランスファーなのか見極めようと思っています。 何かアドバイス頂ければうれしいです。

(無題) 削除/引用 No.1441-2 - 2009/10/30 (金) 05:50:06 - おお とう鎖は何処を外したのでしょうか? とう鎖がないとして、ペプチドのサイズはどれくらいですか? お示しの実験はとう鎖が非常におおきく、1MDa以上も ありそうなものを部分てきにトリミングして400kDaで 検出できた可能性はありませんか? ウエスタンについては、いままでどのような工夫をされましたか? ここの過去ログを読んでいらっしゃるようなので、 繰り返しの指摘はあまり面白くないと感じるでしょうから、、、

プロテオグリカンのウエスタン 削除/引用 No.1441-1 - 2009/10/29 (木) 17:52:59 - 糖鎖 いつも勉強させていただいております。 プロテオグリカンのSDS-PAGEを行っていますが、 その分子量について分からず、困っております。 市販の抗体の添付文書では、80kD前後のWBのバンドが出ていましたが、 、過去の論文ではエタノール沈殿、糖鎖除去の処理などを行った上で400kD以上の位置にバンドが出ていました。 糖鎖修飾を受けるタンパクは分子量が変化するとはいえ、同じタンパク質がここまで変化するものでしょうか？ 私はウエスタンに精通していないのですが、400kD以上の高分子量のタンパクをトランスファーすること自体が困難です。 過去のページから勉強しながら、試行錯誤しておりますが、こちらについてもアドバイスいただけないでしょうか？

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