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(無題) 削除/引用 No.1440-17 - 2009/10/29 (木) 15:08:17 - - Gel running gel 水　　　　　　　　　　　　　　　３．９ｍｌ 30％アクリルアミド　　　　　　　２．５ｍｌ Tris-HCl　ｐH8.8　　　　　　　　３．４ｍｌ 10％SDS　　　　　　　　　　　　０．１ｍｌ 10％APS　　　　　　　　　　　　０．１ｍｌ TEMED　　　　　　　　　　　　　　　７μｌ Stacking　Gel 水　　　　　　　　　　　　　　　３．４ｍｌ 30％アクリルアミド　　　　　　　０．８３ｍｌ Tris-HCl　ｐH6.8　　　　　　　　０．６３ｍｌ 10％SDS　　　　　　　　　　　　０．０５ｍｌ 10％APS　　　　　　　　　　　　０．０５ｍｌ TEMED　　　　　　　　　　　　　　　５μｌ 電圧　電流 Stacking gel 500V　10ｍA Running gel 500V　20ｍA 電気をかけるのですが、なぜかVが500に設定しているのに500まで上がり切りません。

(無題) 削除/引用 No.1440-16 - 2009/10/29 (木) 15:04:22 - ねうろん > --さんが、おっしゃるには、スペーサーをつけたままでよいと、教科書に書いてあるそうですが、皆さんはどうなさってるんでしょうか？ 昔、取り忘れたまま泳動して「なんか流れてないなぁ」って思った記憶があります。 まぁ当然なのですが。 しかしながら、すこーーーしづつ流れますw

(無題) 削除/引用 No.1440-15 - 2009/10/29 (木) 15:03:44 - AP >Tris　　　３０．３ｇ >グリシン　１４４ｇ >SDS　　　 １０ｇ >をdw up で１Lにしたものを１０×Loading buffer　として１０倍希釈して使っています。 Loading bufferではなくてrunning bufferですね。 念のため、pHを測ってみてください。正しく作られていればpH 8.3 (ズレがあったとしてもごくわずか）になっているはずです。試薬を間違えていたり、はかり間違えていると大きくずれます（ずれていても、塩酸やNaOHであわせてはいけません。なおさらおかしくなります。最初から作り直し）。 Tris baseを使うべきところ、Tris.HCl塩（商品名Trizma HClなど)と取り違えたためバッファー組成やpHが狂っているということはありがちです（TAEをつくる場合なんかでも。あとMOPS buffをつくるときにfree-acidを使うべきところMOPSナトリウム塩と間違えるとか）。

次はpHとスタッキングゲルの厚みとスペーサーについてだけ？ 削除/引用 No.1440-14 - 2009/10/29 (木) 15:01:32 - ~ >ｐ６．８と８．８のTris−bufferで私もつくっています。 それらのpHがのトリスが使われることはあります。 ただ、どちらのゲルにどのような濃度で添加し、他の成分が何が入っているのかが分かりません。 >stacking gel はウェルの底から１ｃｍの厚みになるよう作っています。 厚さは問題なさそうですね。 >ガラス板２枚の間にゴム紐をはさんで、その隙間にゲルを流し込んで作りますよね？ これはシリコンゴムのことで、ゲルが固まるまで漏れ出さないようにするためのものですよね。 ゴムは電気を流しませんので、これが付いたままだと電気が流れません。 貴方の表記ミスかこちらの解釈の間違いでなければ、これが怪しいです。 ただ、貴方はこのように少しずつ情報を出して、それについてコメントをしてもらう方法を望んでいるのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1440-13 - 2009/10/29 (木) 14:58:51 - ねうろん Bufferは普通ですけど。 泳動時の電流電圧わかります？ 可能なら泳動槽の名前も。 それと念のためゲルの組成。

(無題) 削除/引用 No.1440-12 - 2009/10/29 (木) 14:58:11 - あべちゃん スペーサーのゴムを挟んだまま、流せるんですかねぇ〜 電気が全く流れないかと言えば、そんなことはないと思いますが、外した場合に比べて極端に電流量が変わりそうな気がします。 スペーサーを外されてはどうですか？ --さんが、おっしゃるには、スペーサーをつけたままでよいと、教科書に書いてあるそうですが、皆さんはどうなさってるんでしょうか？ 僕は、つけたまま流すというのは初耳です。

(無題) 削除/引用 No.1440-11 - 2009/10/29 (木) 14:54:12 - tm ゲルを作成するときに使うパッキンを取らないと，ゲルがbufferに接触しないので泳動されないと思いますが．昔，これをやって流れないと騒いでいた学生がいたのを思い出しました．パッキンはゲル溶液が漏れないようにゲル板に密着させる必要があるわけですから，そのまま泳動に使ったら当然bufferもゲルには接触しませんよね（わずかには水圧などで入ってくるかも知れませんけど・・・）． マーカーが分離されてないということなので，やはりゲルを作成するbufferのpHをチェックするのが先ではないでしょうか．まさかとは思いますが，濃縮と分離を逆にしていませんよね？

(無題) 削除/引用 No.1440-10 - 2009/10/29 (木) 14:18:00 - - すみません。意味を取り間違えていました。 ｐ６．８と８．８のTris−bufferで私もつくっています。 ただ、そのTris-bufferも含め、ゲルを構成する水分がミリQではだめなのかと思ってしまいました。

(無題) 削除/引用 No.1440-9 - 2009/10/29 (木) 14:10:15 - あべちゃん >[Re:7] -さんは書きました : > ミリQでゲルを作っています。ミリQだとゲルに電気が流れないのですか？ だめです。 > 皆さんは何でつくっているのですか？ Trisのバッファーです。 とても基本的なので、良い機会だから実験書を読みましょう。 > あと、ゲルをつくる時に、ガラス板２枚の間にゴム紐をはさんで、その隙間にゲルを流し込んで作りますよね？ > よく泳動の際にゴム紐を取り忘れてしまうんですが、書籍を読むと取らなくて良いものと、取るべきだと書いてあるものとあります。 > 関係ありますか？ ミリQがだめです。 ゴムをつけたまま、というのをきいたことがないので、わかりません。 > > あと、皆さんはrunning gelとstacking gelはどのくらいの比率ですか？ > バンドが重なってしまうのはstacking gel が多すぎるんでしょうか？ ミリQなので、何よりもそこ。

(無題) 削除/引用 No.1440-8 - 2009/10/29 (木) 14:07:03 - toorisugari ９時間かかるのはどこか間違えているのだと思います。 思い切って一度バッファー関係とゲル試薬は既製品を買ってみては？ バイオラッドから出ています。

(無題) 削除/引用 No.1440-7 - 2009/10/29 (木) 14:04:23 - - ミリQでゲルを作っています。ミリQだとゲルに電気が流れないのですか？ 皆さんは何でつくっているのですか？ あと、ゲルをつくる時に、ガラス板２枚の間にゴム紐をはさんで、その隙間にゲルを流し込んで作りますよね？ よく泳動の際にゴム紐を取り忘れてしまうんですが、書籍を読むと取らなくて良いものと、取るべきだと書いてあるものとあります。 関係ありますか？ あと、皆さんはrunning gelとstacking gelはどのくらいの比率ですか？ バンドが重なってしまうのはstacking gel が多すぎるんでしょうか？ ちなみにstacking gel はウェルの底から１ｃｍの厚みになるよう作っています。

なぜ情報を小出しに… 削除/引用 No.1440-6 - 2009/10/29 (木) 13:54:53 - ~ バッファーは問題なさそうですね。 次はゲルと電源でしょうか。 ゲルをMilliQで作っているために、電気が流れずに泳動が遅いとか…

(無題) 削除/引用 No.1440-5 - 2009/10/29 (木) 13:52:18 - う 一度、その辺にいくらでもあるプロトコール集と 全く同じことをやってみてはいかがでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.1440-4 - 2009/10/29 (木) 13:49:17 - - みなさん、ありがとうございます。 バッファーの組成は Tris　　　３０．３ｇ グリシン　１４４ｇ SDS　　　 １０ｇ をdw up で１Lにしたものを１０×Loading buffer　として１０倍希釈して使っています。

(無題) 削除/引用 No.1440-3 - 2009/10/29 (木) 13:36:54 - あべちゃん 泳動時間がそこまで長いのはバッファーの組成が違うのでは？と思わせます。 希釈間違いとか。 バンドの乱れもそういったところから来るのでは？ どういったバッファーを使ったとか、もう少し細かい説明があれば、何とかなるかも。

(無題) 削除/引用 No.1440-2 - 2009/10/29 (木) 13:34:21 - キム 試薬を作り直してみては？

SDS-Pageの泳動が遅い 削除/引用 No.1440-1 - 2009/10/29 (木) 13:26:24 - - こんにちは。 現在、SDS-Pageにおいて困っていることがあり質問させて頂きました。 SDS-Pageでの電気泳動にかかる時間がとても長いことと、マーカーのバンドが重なってしまい、きれいに泳動されないことで困っています。バンドも曲がってしまいます。 サンプルを入れないウェルにはloading bufferを同じ量だけ加えることで、曲がって泳動されてしまうことは少しは改善されましたが、まだ曲がります。 �@前任者の実験ノートでは、２時間で終了できる泳動が９時間近くかかるのはなぜか �Aきちんと泳動されずにマーカーが重なってしまうのを改善したい �B空きウェルを満たしてもバンドが曲がってしまうのをどうにかしたい 以上３つが質問です。 現在手元にある書籍やネットで見ても良いトラブルシューティングが見つかりません。よろしくお願いします。

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