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(無題) 削除/引用 No.1440-37 - 2009/11/02 (月) 21:52:45 - c 泡はゲルカセットを斜めにすればたいてい横から出ます。特に大きな気泡は出やすいです。電気泳動前に確認して、必要に応じてこのようにして除いて下さい。小さい泡（直径１mmくらいのやつ）は泳動には影響しません（というかいままで影響したことないです）ので（あまりたくさんでない限りは）ほっといて泳動しても全然平気です。 質問のようなトラブルは泡が原因ではないようにおもいます。SDS-PAGEの場合、多少pHやゲル組成がズレていても、手技的にあるていどいい加減にやっても、一応普通にできると思いますので、お話から察するにはなにか根本的な部分で大きな誤りか問題があるような気がします。濃縮ゲルと分離ゲルを作る時、pH6.8 bufferとpH8.8 bufferを間違えて逆に使ってるとか表示間違えてるとか。(この場合、分離ゲルに入っても有色マーカーがなかなか分かれない。）とか、10x running bufferを1x running bufferと思って使ってるとかその逆とか。　あとかなり古いSDSをよそで借りてきて使ったときパタンがスメアになったことがあります。考えているよりも、実験のない暇な時にでもストック試薬を一度全て作り直してみるのが早いかもしれません。 時間がもったいないので、レディメイドのゲルとbufferで済ましてとりあえず先に進めるのもまた賢明な選択と思います。（今はそんなに高くないと思うので。）

(無題) 削除/引用 No.1440-36 - 2009/11/02 (月) 20:08:38 - ごんべい 泡で乱れます。 小さいのはともかく、また全面覆われているのは当然として、数レーンに渡るような気泡があった場合、その真上の部分だけ遅くなったりしました。

(無題) 削除/引用 No.1440-35 - 2009/11/02 (月) 10:20:55 - in situ 泡で泳動が乱れたことがあります。 泳動槽の構造によっては泳動槽とゲル板の間に泡がたまっているのか、ゲルの真下にたまっているのか分かりづらいこともありますが、当然ゲルの真下に泡がたまっている時が問題です。 数個泡が張り付いている程度なら問題ないのですが（電流が泡を回りこむ？）、一度確認を怠ってゲルの下辺がほぼ全面泡でおおわれている状態で流したところ、泳動が極端に遅くなりました。

(無題) 削除/引用 No.1440-34 - 2009/11/02 (月) 04:34:42 - A PostDoc >[Re:33] ルンバさんは書きました : > >[Re:32] Aさんは書きました : > > もし気泡が残っているとその > > 部分には電気が流れないので（多分濡れているからわずか > > ながら流れて抵抗が大きくなると思いますが）泳動が遅く > > なったりきれいに流れなかったりすると思います。 > 確かに、泳動の時はこの泡が原因で乱れるのではないかと心配ですが、 > 泡があっても実際に乱れた試しはありません。 > どなたか、実際にこの泡は乱れの原因になると実感された経験のある > 人ってあられますか？ > 個人的には、泡が問題になったことはないです。実験書には丁寧に泡を飛ばすように書いてありますが・・・。バッファーとゲルの接線すべてが空気で覆われているのは問題でしょうが、少しくらいは良いのでは？ 時々プレキャストゲルを使いますが、構造的に泡を飛ばしづらい（シリンジやニードルが届かない）ものもあるくらいです。他の方のご経験もお聞きしたいですね。

(無題) 削除/引用 No.1440-33 - 2009/11/02 (月) 02:01:36 - ルンバ >[Re:32] Aさんは書きました : > もし気泡が残っているとその > 部分には電気が流れないので（多分濡れているからわずか > ながら流れて抵抗が大きくなると思いますが）泳動が遅く > なったりきれいに流れなかったりすると思います。 確かに、泳動の時はこの泡が原因で乱れるのではないかと心配ですが、 泡があっても実際に乱れた試しはありません。 どなたか、実際にこの泡は乱れの原因になると実感された経験のある 人ってあられますか？

(無題) 削除/引用 No.1440-32 - 2009/11/02 (月) 01:46:25 - A スペーサーを外すとゲルの底に隙間が残ると思います。 ランニングバッファーを注いだ後そこに気泡が残って いないか確認されてます？もし気泡が残っているとその 部分には電気が流れないので（多分濡れているからわずか ながら流れて抵抗が大きくなると思いますが）泳動が遅く なったりきれいに流れなかったりすると思います。

(無題) 削除/引用 No.1440-31 - 2009/10/30 (金) 01:23:13 - あかね 皆さんのコメントを全部見ていないので、既出かもしれませんが、 以前、研究室でSDS-PAGEがおかしく、いろいろ調べた結果、 SDSのPHがおかしいことが原因でした。。。 その時は粉末のSDSではなく20%のSDS溶液を購入していたのですが、 その溶液のpHが異常値（酸性かアルカリかは忘れました、確か酸性）というオチでした。 そんなことあるのか、と思い、全く新しいボトルを開けたところ、 そのPHもおかしく、結局、そのロットのSDS全てが問題だったようです。 そういう事もあるという話でした。

(無題) 削除/引用 No.1440-30 - 2009/10/30 (金) 01:16:52 - おお ちょっと乱暴ですが、売っているプレキャストゲルとバッファーを 使ってみてはどうでしょうか。 ずっと買い続けれるならそれでいいですけど、 いちどためしてみて、どういうふうにながれるかとか みてみれば、系が働いている時はどうなるか分かると思えますが、、、

ありがとうございました 削除/引用 No.1440-29 - 2009/10/29 (木) 19:15:29 - - みなさんのおかげで、だいぶ怪しいポイントがわかってきました！ 本当にありがとうございます。 まずは、バッファー系を作り直して、その際に厳しくｐHチェックをしてみます。みなさんの教えて下さった意見を総合してミリQで作りたいと思います。 私の研究室では初めての試みのため、周りに指導してくれる人がいなかったので、手探りの私にとって、とても助かりました！ やっぱり百聞は一見にしかずで、みなさんのおっしゃる通り、誰か指導してもらえそうな人もあたってみます。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.1440-28 - 2009/10/29 (木) 17:31:24 - ~ >[Re:26] ねうろんさんは書きました : > 機種によるのでしょうが、450Vは高すぎだと思うのですが。。。 > 私が使っている泳動槽なら同程度の条件で45Vとかだと思います。 私は60~80V位だったと思います。 >>皆さん > 泳動バッファーって何で作ってます？ > MilliQ？DW？水道水？ お金のあるラボにいるときはMilliQ、MilliQの使用がうるさいラボにいるときはDWでした。 水道水でやっているラボは見たことがありません。 10〜20mAが流れるために450Vというのであれば、pHよりも塩濃度が怪しいと思います。 試薬を一通り作り直すのが始めの1手かと思います。

(無題) 削除/引用 No.1440-27 - 2009/10/29 (木) 17:14:10 - 気になる。 はやくBufferのpHを測って！

(無題) 削除/引用 No.1440-26 - 2009/10/29 (木) 17:06:30 - ねうろん 機種によるのでしょうが、450Vは高すぎだと思うのですが。。。 私が使っている泳動槽なら同程度の条件で45Vとかだと思います。 >>皆さん 泳動バッファーって何で作ってます？ MilliQ？DW？水道水？ 私はMilliQですが、違いとかってでたりしますか？ 後ろにいくにつれて抵抗が上がりそうですが。 うーん、そうするとやはりBufferが怪しいのだけど。。。 あとはパワーサプライの問題とか。。。

(無題) 削除/引用 No.1440-25 - 2009/10/29 (木) 16:39:26 - ; なんか電気抵抗が高い気がするのですが。。。。 設定は20m、A500Vだとしても 実際に流れている電流はどうですか？ 電源の機械には見ることができるようになっていると思います。 時間が経つとどんどん電気は流れにくくなっていきます。 泳動しはじめた時、中盤、終わりでどうなっていますか？ 何となく最初っから450Vであとは500Vになってしまっていて 後半になると500Vでも目的の電流値まであがらない低電流値で ゆーーーーくりとした泳動になってしまっているのでは？ 私は、泳動に関わるBuffer（分離ゲル用、濃縮ゲル用、泳動Bufer）を すべて見直すことをお勧めします。 それが変だと、タンパク質はきちんと泳動できないは 時間は長いはで、いいことないです。 それだけは、自分で作っていいて間違いないと思い込んでいることもあるので 人にチェックしてもらうと効果的だと思います。 どなたかも言われていますが、誰かいないのですか？

(無題) 削除/引用 No.1440-24 - 2009/10/29 (木) 16:37:16 - tm どこのゲル板や泳動槽を使っているのか分かりませんが，もうひとつ思い出したのが，サンプルを乗せる切れ込みの部分を逆に（下部リザーバー側というのかな）セットして，やはり泳動されないと騒いでいる学生がいました．サンプルを乗せるゲル上部が上部bufferに接触しませんから，これじゃ電流流れませんね．あとは，上部下部ともにbufferを満たしすぎだと（bufferが別々になってないと）うまく泳動されないかも．

(無題) 削除/引用 No.1440-23 - 2009/10/29 (木) 16:16:48 - - だいだい４５０ｖくらいまで上がっています。 ゲルの大きさは大まかですが１０ｃｍ×１０ｃｍくらいです。 巨大なゲルではないですよ！

(無題) 削除/引用 No.1440-22 - 2009/10/29 (木) 16:15:04 - - スペーサーのゴムはつけていても、つけていなくても変わりありませんでした。 結局、最近では外していますが最低でも６時間はかかります。 時間をかけて泳動したにもかかわらず、結局、下の方のバンドはダンゴになってくっついてしまっています。

(無題) 削除/引用 No.1440-21 - 2009/10/29 (木) 16:03:29 - ねうろん あ、500Vの設定ですか。50Vかと思った。 おおまかでいいのですが、実際の値、わかります？

(無題) 削除/引用 No.1440-20 - 2009/10/29 (木) 15:26:25 - ねうろん 流れてはいるっぽいですね。 もの凄いデカいゲルを使ってたりして。 （組成をみると1.0mm-8cm位のミニゲルのようですが） あと、皆さん親切に答えて下さっているのですから、可能であればそれぞれの質問に返答した方が良いと思いますよ。 結局スペーサーつけたまま流しているのかそうでないのか、とかまだはっきりしてないですし。

(無題) 削除/引用 No.1440-19 - 2009/10/29 (木) 15:18:07 - う やはり、一度同じ研究室、いないのであれば同じ大学で他の研究室の SDS-PAGEをやっている人に、直に教えてもらうことを 強くお勧めします。 基本は大事。

(無題) 削除/引用 No.1440-18 - 2009/10/29 (木) 15:16:04 - う ＞なぜかVが500に設定しているのに500まで上がり切りません 当たり前。

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