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御解答ありがとうございます 削除/引用 No.1432-8 - 2009/10/31 (土) 21:24:20 - ウェスタン初心者 ご回答ありがとうございます。 やはり、相当シグナル強度が強ければ ということですね。 次の実験ではフロントラインかメンブレンの先をカットしてみようかと思います。 お世話になりました。 おかげで問題が解決しました。 本当にありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.1432-7 - 2009/10/29 (木) 23:27:40 - TS >ただ、気になることが、例のシグナルの強い非特異にHRP基質が消費されて >目的のバンドが使うHRP基質が目減りしているのではないかということです。 >あり得ないことでしょうか？ もちろん少しは抗体やHRP基質が持ってかれているはずですし、問題になるかどうかは、そのシグナルの強さの程度によるとは思います。 バンドが白抜けするようなシグナル強度であれば、少々気になるかもしれません。 結局のところ、SDS-pageで分離もされてなく、他のIBにも使えない領域ですし、メンブレンをカットしてしまえばすっきりするのではないでしょうか？

ありがとうございます 削除/引用 No.1432-6 - 2009/10/29 (木) 23:00:15 - ウェスタン初心者 皆さん、ご回答ありがとうございます。 お早いご回答にも関わらず、御礼が遅くなり申し訳ございません。 なるほど、7.5% gelでは分離し切れなかった低分子量蛋白質がフロントラインで濃縮されて強い非特異的シグナルが出ていたのですね。 c様 ＞見ている非特異シグナルは15KDaかどうか分からないとおもいます。 実はその通りで、分子量は低い15KDaかも分かりません。 僕が転写すると、25KDa以下のMWマーカーは見えなくなるので・・・大体です。 おお様 ＞ただ、7。5%なので15%くらいで一度流してみて何か意味があるもの なのか確認はしてみた方がいいと思います。 確かに、22KDaの蛋白質を検出する機会があって、そのときは15%gelで流したのですが、低分子量の非特異が出なかった気がします。 TS様 ＞7.5%ゲルでやってるということですので、おそらく目的タンパク質の分子量は、小さくとも50kDa以上ですよね？ ＞わたしは、WBでは目的のバンドさえ出ていれば、他のバンドがあろうがなかろうがどうでもいいと考えていますので、気にしません。 それに、たいがいの場合、目的タンパク質の分子量にあわせて、メンブレンを短冊状に切ってBlotするので、そのような目的タンパク質の分子量と離れたところにバンドが出てしまうかどうかも、確認しません。 そうです。目的のバンドは、67KDaです。 確かに、目的のバンドがある程度出てバックが低ければ、非特異バンドは問題ないものですよね。 ただ、気になることが、例のシグナルの強い非特異にHRP基質が消費されて 目的のバンドが使うHRP基質が目減りしているのではないかということです。 あり得ないことでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1432-5 - 2009/10/29 (木) 00:01:45 - TS 答えにはなっておりませんが。 私も同様の経験をしたことがあります。私が持っていた勝手な解釈は、７％程度のゲルの場合、おっしゃるとおり、30kDa程度以下は、SDS-pageでほとんど分離できません。一方で、Western blottingは、ゲルをまるまるBlotしたとき、単一のバンド出ることは、実際のところ比較的少ないとも感じています（目的タンパク質以外の特異的なバンドが出ます）。そこで、ぎゅぎゅっとタンパク質が濃縮されている低分子領域には、やはり抗体と反応するタンパク質が１つくらいあったりして、それが原因で強いシグナルが検出されるのでは？　というものです。 わたしは、WBでは目的のバンドさえ出ていれば、他のバンドがあろうがなかろうがどうでもいいと考えていますので、気にしません。 それに、たいがいの場合、目的タンパク質の分子量にあわせて、メンブレンを短冊状に切ってBlotするので、そのような目的タンパク質の分子量と離れたところにバンドが出てしまうかどうかも、確認しません。 わたしが雑把すぎるのかもしれませんが、WBの経験が多い人ほど、この程度の感覚でやっているのが実際のような気がします。 7.5%ゲルでやってるということですので、おそらく目的タンパク質の分子量は、小さくとも50kDa以上ですよね？

(無題) 削除/引用 No.1432-4 - 2009/10/28 (水) 23:59:11 - おお タンパクがマイグレーションする最先端の位置はどう言う訳か バックグランドがで易いですね。タンパクや抗体にもよると思いますけど。 もし邪魔なら、ダイを流しきるかその部分をカットしてウエスタン しても良いかと思いますけど。 ただ、7。5%なので15%くらいで一度流してみて何か意味があるもの なのか確認はしてみた方がいいと思います。7。5%だと25kDa以下は最先端に マイグレートしてしまいますので。

追加 削除/引用 No.1432-3 - 2009/10/28 (水) 23:35:19 - c ゲル濃度見忘れてましたので、追加します。7.5%というと30Kから下くらいはみんな一緒になってフロント付近に来てるように思います。よって見ている非特異シグナルは15Kかどうか分からないとおもいます。血清や動物組織サンプルだと、2次抗体が内在性のIgGの軽鎖(30~20KDa)と反応している可能性があります。（実際そういうことは多い）これも2次抗体だけでやってみてどうなるか見れば判断つきます。もしigGならばこれは当然の結果なので、邪魔にならないなら無理にどうこうする必要ないですが、その付近にシグナルあると見たいものが隠れて困るならば内在性のIgGと反応しない検出試薬やHRP-protein A/Gなど使えば良いでしょう。

(無題) 削除/引用 No.1432-2 - 2009/10/28 (水) 23:24:06 - c たぶんいま使っている２次抗体が何か変なものと反応しているようにおもいますので、１次抗体無しで一度やってみて、同じような感じならば、2次抗体を別の会社のものに変えてみることを勧めます。

低分子量に非特異バンド 削除/引用 No.1432-1 - 2009/10/28 (水) 22:22:19 - ウェスタン初心者 今晩は。western blotをやっている大学生です。 western blotで困っていることがあります。 分かる方がいらっしゃいましたら是非、アドバイスをご教示下さい。 western blotである蛋白質を検出しているのですが、 低分子量（15 KDa付近）に、シグナルのとても強い非特異的なバンドが検出されます。 コントロールで検出するGAPDHよりもシグナルは遥かに強いのです。 GAPDHとは別の抗体を使って目的の蛋白質は少し微弱ながらも検出されるのですが、やはり15KDa付近にとても強い非特異的バンドが検出されます。 protocolは以下の通りです。 SDS-PAGE 7.5% gel 200V const,40min protein：5μg/well blotting PVDF menbrane 100Vconst 50min blocking Ez block （×1） 5ml（menbraneが浸る最小の量です） 希釈はTBStween（0.05% tween-20） 30min 振とう wash TBS-tweenで10min×3 交換のたびに少しリンスしています。 Antibody（濃度は下記のもので統一しています） 1st：1/10000 in TBS-Tween 12h at 4℃ 2nd：1/30000 in TBS-Tween 60min at RT 反応は湿潤箱の中で、平行に設置したガラス板の上に静置して行っています。 発光はHRPによるケミルミで検出しています。 この情報で同じ経験をしたり、何か原因が分かる方がいらっしゃいましたらどうか、 解決策や原因をご教示下さい。 下らない質問ですがどうかよろしくお願いします。

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