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Re: おおさん 削除/引用 No.1429-14 - 2009/10/29 (木) 10:06:24 - タル > コドン使用頻度の問題はないかなぁ、、、、 　http://www.kazusa.or.jp/java/codon_table_java/　に Homo sapiens と Drosophila melanogaster の使用頻度がありました。それによると、コドンとアミノ酸の対応は２種で同一で、使用頻度もTCG, CCG, ACG, GGGの四つを除いて大きくは違っていませんでした。四つのうち、TCG, CCG, ACGはDrosophilaがヒトの2倍以上の頻度で使用しており、GGGのGlyのみヒトの1/2以下でした。ただ、それでもGGGはDrosophilaのGlyを指定するコドンの中で9%を占めているようで、ヒト23%と比べて少ないことが原因で発現が0になることはあまりないような気がします。 　おおさん、貴重なご意見どうもありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.1429-13 - 2009/10/29 (木) 00:02:03 - おお コドン使用頻度の問題はないかなぁ、、、、

Re: ;さん 削除/引用 No.1429-12 - 2009/10/28 (水) 20:14:58 - タル 　;さん、情報不足な書き込みで済みませんでした。 > AヒトCHOベクター→CHO細胞→発現する > aマウスCHOベクター→CHO細胞→発現する > > AヒトD.Me-2ベクター→D.Me-2細胞→発現しない > aマウスD.Me-2ベクター→D.Me-2細胞→発現する > > この４つはそれぞれ全く比較の参考にならないものたちであると思います。 > だって、ベクターが違うし、インサートは違うし、細胞が違うし、で同じパラメーターで比較できるのがないのですから。 当初、インサートの違いはマウスとヒトの種の違いで、それはD.Mel-2という昆虫細胞では似たようなものだろうと考えていました。確かにORF以外の配列を含めて考えますと違うインサートであり、コンストラクト作成に用いる酵素も違ってきます。 > 結局、私だったら、「AヒトD.Me-2ベクター」のコンストラクトを疑います。 > 難しく考える前に。 　コンストラクトを見直して再度作成してみようと思います。また、aマウスD.Mel-2ベクター及びAヒトD.Mel-2ベクターをCHOに、逆にAヒトCHOベクター及びaマウスCHOベクターをD.Mel-2に導入して発現するかも確認してみようと考えております。 ;さんおつきあいいただきありがとうございました。

Re: ~さん 削除/引用 No.1429-11 - 2009/10/28 (水) 20:01:24 - タル > その場合に、全長を読んでいなかった点が気になりませんか？ > CHOでそのベクターが発現すればいいのですが、しなければベクター自体を疑うべきかと思います。 ~さん、貴重な意見をありがとうございました。CHOとD.Mel-2のベクターを交換して導入し、発現するかを確認してみたいと思います。それと同時に、もしかしたら必要な配列を切り取ってしまっている可能性があるかもしれないので、もう一度コンストラクトを見直して作成してみます。

(無題) 削除/引用 No.1429-10 - 2009/10/28 (水) 18:30:34 - ； ？？？ ということは、 目的Aヒト遺伝子があって、aマウス遺伝子もある。 これらの遺伝子はそれぞれ２つのベクターに組み込まれている。 つまり、記号化すると AヒトCHOベクター　および、AヒトD.Me-2ベクター aマウスCHOベクター　および、aマウスD.Me-2ベクター この４つがあるということですか？ それを、細胞に次の組み合わせで導入すると発現パターンは次の通り AヒトCHOベクター→CHO細胞→発現する aマウスCHOベクター→CHO細胞→発現する AヒトD.Me-2ベクター→D.Me-2細胞→発現しない aマウスD.Me-2ベクター→D.Me-2細胞→発現する もし、こうなるとすると、 最初の書き込みで ＞発現していないのはD.Mel-2にヒトのホモログを入れたときです と書いてあると、「他のすべての条件が同じなのに発現しない」という印象を受けますが、 この４つはそれぞれ全く比較の参考にならないものたちであると思います。 だって、ベクターが違うし、インサートは違うし、細胞が違うし、で同じパラメーターで比較できるのがないのですから。 つまり、私も他の方がご指摘の通り、「AヒトD.Me-2ベクター」のコンストラクトがおかしいと思います。 それと、最初の書き込みでは ＞FACS, ウェスタンブロット双方で、使用抗体もD.Mel-2のときと同じです。 とあったので、マウスとヒトのタンパク質を同じ抗体で検出できているのかと思いましたが、 後の書き込みでは ＞抗体が異なるため、抗原への親和性が違ってくると思います。 結局、「aマウスタンパク質は発現しているのに、Aヒトタンパク質は発現しない」というまでの 比較は抗体でできていないということですね。 だって、マウスとヒトのを検出する抗体は違うものでしょう？ つまり、抗Aヒト抗体で検出したら、 AヒトCHOベクターでは検出できた AヒトD.Me-2ベクターでは検出できなかった というだけで、これに「aマウスではどちらも検出できるのに」という情報はあまり関係無いのではと。 結局、私だったら、「AヒトD.Me-2ベクター」のコンストラクトを疑います。 難しく考える前に。

(無題) 削除/引用 No.1429-9 - 2009/10/28 (水) 17:32:00 - ~ >切り出して新たに作成したものに関しては制限酵素によるチェックで済ませております。 ベクターとインサートの組み合わせからして、おそらくは作ったベクター自体にトラブルの原因があるような気がします。 その場合に、全長を読んでいなかった点が気になりませんか？ CHOでそのベクターが発現すればいいのですが、しなければベクター自体を疑うべきかと思います。

Re: ;さん 削除/引用 No.1429-8 - 2009/10/28 (水) 17:21:25 - タル > 目的Aヒト遺伝子があって、aマウス遺伝子もある。 > これらの遺伝子は同じベクターに組み込まれている。 > > aマウス遺伝子を組み込んだベクターを導入すると > CHO, D.Me-2双方で発現が確認できる。 > > しかし、Aヒト遺伝子を組み込んだベクターを導入すると > CHOでは発現するが、D.Me-2では発現しない。 > ということですよね。 　CHO, D.Mel-2に導入した発現用ベクターはそれぞれ異なるものですが、その点以外はご記述の通りです。 > この、発現するというは、transientでの発現でしょうか？ 　はい、transientでの発現をFACS, ウェスタンブロットで検出しています。 > それと、発現するという細胞において、発現量は同じでしょうか？ 　発現タンパク質の定量は行っていません。また、抗体が異なるため、抗原への親和性が違ってくると思います。その点を無視すれば、aマウス遺伝子の方が多いです。的外れな回答かもしれませんが、CMVプロモータをつけたベクターにはIRES-EGFPがあり、そのMFIを測定しますと、aマウスとAヒトとで同一でした(CHO)。 > ＞2つの異なるコンストラクトをおのおの複数クローン作成してトランスフェクション > どういうことですか？ 　文章が下手ですみませんでした。同じベクター・インサートを異なる酵素で切断して2つのコンストラクトを作成していました。また、ライゲーションして出来上がったコロニーも制限酵素でチェックした後、複数クローン回収していました。

Re: ~さん 削除/引用 No.1429-6 - 2009/10/28 (水) 16:45:28 - タル > CHOに入れたCMVプロモーターのベクターを、D.Mel-2に入れてみてはいかがでしょうか。 > また、CHOにその誘導プロモーターで入れてみてはいかがでしょうか。 　ご意見ありがとうございます。さっそく試してみたいと思います。 > 配列はちゃんと全長読めていますか？ 　現在のベクターに組み込む前にインサートの配列を読んでおり、問題ないことを確認しています。ただ、切り出して新たに作成したものに関しては制限酵素によるチェックで済ませております。

(無題) 削除/引用 No.1429-5 - 2009/10/28 (水) 14:04:34 - ； 読解力がないのでよく把握できていないですが、 ＞2つの異なるコンストラクトをおのおの複数クローン作成してトランスフェクション どういうことですか？ まぁそれはそれとして、細かいことなのでどうでもいいですかね。 簡単にまとめさせてもらうと、 目的Aヒト遺伝子があって、aマウス遺伝子もある。 これらの遺伝子は同じベクターに組み込まれている。 aマウス遺伝子を組み込んだベクターを導入すると CHO, D.Me-2双方で発現が確認できる。 しかし、Aヒト遺伝子を組み込んだベクターを導入すると CHOでは発現するが、D.Me-2では発現しない。 ということですよね。 この、発現するというは、transientでの発現でしょうか？ それと、発現するという細胞において、発現量は同じでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1429-4 - 2009/10/28 (水) 13:05:05 - ~ 同じベクター系で入った実績があるのですから、 次に疑うべきは導入しているベクター自体だと思います。 配列はちゃんと全長読めていますか？ CHOに入れたCMVプロモーターのベクターを、D.Mel-2に入れてみてはいかがでしょうか。 また、CHOにその誘導プロモーターで入れてみてはいかがでしょうか。 これで、ベクターに問題があるかを確認できると思います。

(無題) 削除/引用 No.1429-3 - 2009/10/28 (水) 11:03:01 - タル ~さんありがとうございます。 > 一番最初に疑問を持ったのは、この細胞はおそらく浮遊細胞ですよね？ > リポフェクションは浮遊細胞への導入効率はかなり悪いと思います。 　D.Mel-2は細胞濃度によってSuspension CulturesとAdherent Culturesの双方が可能なようです(http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/3912.pdf)。おっしゃるとおり導入効率はあまり高くはありません。pMT/V5-HisBというベクターとpuromycin耐性プラスミドとで共導入しており、マウスホモログの場合はpuromycin選択後約10%の細胞が発現します。 > 導入したことのあるベクター（出来れば蛍光たんぱく質発現ベクター）をコントロールにおくことで、貴方が操作した際の導入効率が分かると思います。 　上記のように、マウスホモログを陽性コントロールとして同じプロトコルで導入を行っております。マウスホモログは10%程度の陽性細胞を得られますので、導入効率が低くても陽性クローンを得ることは可能だと考えています。 　蛍光タンパク質はつけておらず、検出はそれぞれのモノクローナル抗体で行っております。 以下が現在の状況です。 細胞CHOD.Mel-2 プロモータCMVmetallothionein (Drosophila) マウスホモログ○○ 目的タンパク(ヒト)○× ※○で発現を検出しています。

(無題) 削除/引用 No.1429-2 - 2009/10/28 (水) 09:23:42 - ~ 一番最初に疑問を持ったのは、この細胞はおそらく浮遊細胞ですよね？ リポフェクションは浮遊細胞への導入効率はかなり悪いと思います。 この試薬は、貴方のラボで細胞への遺伝子導入の実績があるのでしょうか？ あれば、導入したことのあるベクター（出来れば蛍光たんぱく質発現ベクター）をコントロールにおくことで、貴方が操作した際の導入効率が分かると思います。 ラボや研究所内にあれば、エレクトロポレーションなどの他の導入方法も試してみればいかがでしょうか。

トランスフェクションしても発現しない理由について 削除/引用 No.1429-1 - 2009/10/28 (水) 07:37:56 - タル 初めて書き込ませていただきます、よろしくお願いします。 現在D.Mel-2 (Drosophila) にinvitrogenのlipofectamin LTXで遺伝子導入を行っています。しかし、FACSおよびウェスタンブロットでその発現を検出できていません。以下に気になる点を書かせていただきます。 ･インサートを切り出した元の発現用ベクターでは、CHOでの発現を確認しています。FACS, ウェスタンブロット双方で、使用抗体もD.Mel-2のときと同じです。 ･2つの異なるコンストラクトをおのおの複数クローン作成してトランスフェクションしましたが、発現を確認できていません。 ･同じベクター･トランスフェクション方法で作成したマウスホモログの発現はCHO, D.Me-2双方で確認できています。(発現していないのはD.Mel-2にヒトのホモログを入れたときです) 以上が現在の状況です。発現しない理由についてお知恵をいただければと思っております。よろしくお願いします。

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