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(無題) 削除/引用 No.1428-13 - 2009/11/03 (火) 11:46:29 - おお >[Re:11] pさんは書きました : > > ご存じあるかとは思いますが、例えば転写因子を扱う場合。長く剪断しても短くても、バックグラウンとの違いはプロモーター領域をスキャンするように複数のプライマーを設計し、特定の領域でシグナルが濃縮されるかを検討する必要があると思います。目的遺伝子のコーティングリージョンを完全なネガティブ領域とすることもありでしょう。転写因子が結合する領域を山としたようなqPCRデータが得られるかと思います。 あ、なるほどわかった。 ありがとうございます。 ちょと私の実験の場合どうしたらいいか考えてみます。 > > また剪断ですが、私のお薦めはペンシルタイプのチューブに突っ込んでやる超音波破砕機ではなく、バイオラプラーのように液中を回転させながら超音波処理するタイプの機械です。圧倒的に再現性に優れていますし、多検体を同時に処理できます。これですと一度系を確立してしまえば、DNA断片の大きさはそろえやすいです。 そういうのがあるのは知ってるんですけど、、手元にないなあ、、、 まわりさがしてみよーっと。

(無題) 削除/引用 No.1428-12 - 2009/11/02 (月) 20:22:31 - ｇｇ 逆にソニケーションをかけすぎるとどうなるのでしょうか？私はバイオラプターを使っています。あるひとに聞いた話では　DNAはヒストン蛋白に一巻きあたり147bpなので、ソニケーションをしすぎでも、それ以上は小さくなることはないと聞きますが・・・

(無題) 削除/引用 No.1428-11 - 2009/11/02 (月) 11:03:36 - p > 長くすると目的のところ以外についているのに拾えてくる可能せい > がありそれをバックグランドということで説明があったと思いますが、 > 確かに長いのは解釈がぼける可能性がありますね。 > > 転写中心にChip-ipしている研究室の人と話す機会がありました。 > 彼らは平均600bpの大きさになるようにゲノムをちぎっているようです。 > ですからまあ200ぐらいに抑えるのが妥当化なぁと、、、 > 500bp位にしないとどうも都合が悪そうなのもあるので1000bpくらいの > サイズにゲノムをちぎろうかとか思ったりもしますが、こういうのって > タイトにコントロールできるのでしょうかね。 ご存じあるかとは思いますが、例えば転写因子を扱う場合。長く剪断しても短くても、バックグラウンとの違いはプロモーター領域をスキャンするように複数のプライマーを設計し、特定の領域でシグナルが濃縮されるかを検討する必要があると思います。目的遺伝子のコーティングリージョンを完全なネガティブ領域とすることもありでしょう。転写因子が結合する領域を山としたようなqPCRデータが得られるかと思います。 また剪断ですが、私のお薦めはペンシルタイプのチューブに突っ込んでやる超音波破砕機ではなく、バイオラプラーのように液中を回転させながら超音波処理するタイプの機械です。圧倒的に再現性に優れていますし、多検体を同時に処理できます。これですと一度系を確立してしまえば、DNA断片の大きさはそろえやすいです。

(無題) 削除/引用 No.1428-10 - 2009/11/02 (月) 06:19:44 - おお 回答していただいた皆さんありがとうございました。 確かに何を見るかでしょうね。しかしChip-ipをこなしている研究室は 起用に方法を必要におおじてモディファイしているみたいですね。 長くすると目的のところ以外についているのに拾えてくる可能せい がありそれをバックグランドということで説明があったと思いますが、 確かに長いのは解釈がぼける可能性がありますね。 転写中心にChip-ipしている研究室の人と話す機会がありました。 彼らは平均600bpの大きさになるようにゲノムをちぎっているようです。 ですからまあ200ぐらいに抑えるのが妥当化なぁと、、、 500bp位にしないとどうも都合が悪そうなのもあるので1000bpくらいの サイズにゲノムをちぎろうかとか思ったりもしますが、こういうのって タイトにコントロールできるのでしょうかね。 あと転写を考えるならルシフェラーゼアッセイは確かに考える可能性は ありますし、直接の結合を考えるならEMSAはしないといけないでしょうけど、 間接ならライセートもありかもしれませんね。 ただこの辺はちょっと狙っているところをあまり表に出したくありませんので しょっと議論はおいておこうとおもいます。

Chip PCRプロダクトの長さ 削除/引用 No.1428-9 - 2009/11/01 (日) 23:57:56 - ぽ 私は、１０００ｋｂくらいでクロマチンを断片化し、１００ｂｐ程のプライマーを使ってリアルタイムPCRを使用してます（論文を参照に設計しました） あまり大きいと、目的のリージョンより離れているBinding siteを持つリージョンのクロマチン断片も拾う可能性も高い気がしてますが、、、（バックが高くなる？） 見せ方は色々とあると思いますが、Binding siteが複数あって、どれが重要で促進的に働く　OR　抑制的に働くとか、Luc　AssayやEMSAなど必要にはなってくるので、あまり細かく気にしても、Chip だけでは弱いのかなって気はしますが… 詳しい方、返信よろしくお願いします

みるものによって 削除/引用 No.1428-8 - 2009/11/01 (日) 23:21:35 - あべちゃん ３年くらい前に、白髭克彦先生のラボに在籍していた方に、教えてもらった際、 ソニケーションでゲノムを５００−１０００ｂｐに剪断し、PCRは１００−１５０ｂｐのアンプリコンになるように、アドバイスをもらいました。 これで注意したいのは、何を見るかだと思います。 ヘテロクロマチンとユークロマチンを区別するのか、或いは特定の転写因子が特定のプロモーター領域に結合するのかを見るのかなどによって、ソニケーションによるゲノムの剪断をどの程度にするかが変わってきて、その剪断サイズによって、PCR産物のサイズをどの程度にすべきか、考慮する必要があると思います。 上述した条件は、ヘテロクロマチンの有無をみるという実験の際の条件です。

(無題) 削除/引用 No.1428-7 - 2009/10/30 (金) 11:05:03 - おお >[Re:4] Bostonさんは書きました : > 大抵、100-150 bp。場合によっては 300 bp というのもあります。ソニケーションを頑張っても、180 bp より大きな DNA 断片（360, 540 ... bp）はかなり残ります。PCR product に結合するエチブロの絶対量（シグナルの強さ）を考えても、300 bp 程度であればデメリットよりメリットの方が大きいように感じます。 ありがとうございました。300くらいでも支障なさそうですね。 そのへんを基準にしたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.1428-6 - 2009/10/30 (金) 11:02:49 - おお >[Re:5] 植物屋さんは書きました : > おおさん、 > 説明不足でした。 > うちではリアルタイムPCRで検出するので、最大150bpくらいが限界で、60bpはちっちゃいけどあり。と思ってました。 > > 同じサンプルを普通のPCRでも確認してるみたいですが、そっちのアンプリコンは150bpくらいです。 ありがとうございました。リアルタイムはしないと思いますが、 長さに応じた検出系は選択することが可能と思いますので、、、、、 150bps位でもやられてるんですね。 ちょっと小さくできないのもあるので500以下で考えてみようかと思います。 いろんな個所を作ってるんですけどだいたい平均250位になりそうです。

(無題) 削除/引用 No.1428-5 - 2009/10/30 (金) 10:16:17 - 植物屋 おおさん、 説明不足でした。 うちではリアルタイムPCRで検出するので、最大150bpくらいが限界で、60bpはちっちゃいけどあり。と思ってました。 同じサンプルを普通のPCRでも確認してるみたいですが、そっちのアンプリコンは150bpくらいです。

(無題) 削除/引用 No.1428-4 - 2009/10/30 (金) 04:45:04 - Boston 大抵、100-150 bp。場合によっては 300 bp というのもあります。ソニケーションを頑張っても、180 bp より大きな DNA 断片（360, 540 ... bp）はかなり残ります。PCR product に結合するエチブロの絶対量（シグナルの強さ）を考えても、300 bp 程度であればデメリットよりメリットの方が大きいように感じます。

(無題) 削除/引用 No.1428-3 - 2009/10/30 (金) 01:39:21 - おお >[Re:2] 植物屋さんは書きました : > もう解決済みかもしれませんが、一応。 > > うちのラボのchipでは60~70ｂｐです。 ちっけー!! あ、どうもありがとうごさいました。

(無題) 削除/引用 No.1428-2 - 2009/10/29 (木) 17:58:27 - 植物屋 もう解決済みかもしれませんが、一応。 うちのラボのchipでは60~70ｂｐです。 このプライマーの設計は、大御所ラボからもらったそうです。 私自身がやってるわけじゃないので、あくまで参考まで。

Chip PCRプロダクトの長さ 削除/引用 No.1428-1 - 2009/10/28 (水) 07:33:59 - おお Chip PCRされているかた。PCRプロダクトはどれくらいの長さで プライマーを設定されているでしょうか。 あるいは参考にされた文献などでだいたいどれくらいの長さ のものをよく見るとか、、、

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