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(無題) 削除/引用 No.1426-15 - 2009/11/17 (火) 09:46:56 - kobu 私の先輩はスライドグラスの裏面に油性ペンで胚を置くスペースに円を書き、その円の表面にはベクターシールドを一滴、そしてその中に胚を１つ。 小カバーグラスを置く四隅にはベタベタした樹脂のようなもの（ワセリンだと思います。シリンジの中に入れて保管していました）を四隅四点に付けて、カバーグラスを置き、カバーグラス面をレンズに向けて撮影していました。

(無題) 削除/引用 No.1426-14 - 2009/11/16 (月) 22:24:50 - りんご みなさんありがとうございます！！ えんぶりおさん、 胚がつぶれてしまって目的タンパク質の局在を確認できないので、 きれいな状態の胚が欲しいなと思ってたくさん質問させていただきました！ あと、見た目的にもきれいな球状の方が写真にした時きれいかなと思いました。 APさん、 適当な厚みのスペーサーということで調べてみたところ、 ワセリンなどでAPさんの言うようにコの字などで土手を作る方法もありました！！ 試してみたところ密封性もあり良さげでした！！！ 本当にみなさんありがとうございました！！！ 皆さんのおかげで壁を越えられそうです！！ 皆さんに教えていただいた方法でもう一度行ってみようと思います＞＜

(無題) 削除/引用 No.1426-13 - 2009/11/15 (日) 23:11:11 - AP >prolong goldに移した瞬間にひしゃげるのでやはりprolong goldの影響が大きい気がします。 一般論ですが、 急激に脱水するためではないでしょうか。マウントしてからしばらく時間を置けば、溶媒が置換・平衡化してもとにもどるのでは。サンプルや見たい構造によっては急激な脱水がmorphologyを損なうので、本当はメディウムは徐々に置換するのが理想的なのですが。 ホールマウントの場合、カバーグラスを直接かぶせてスライドグラスに密着してしまうとつぶれてゆがみます。そういうときは、適当な厚みの下駄（スペーサー）をかませるといいと思います。古くは、カバーグラスの向かい合う二辺の下に細長く割ったカバーグラスを置いてカバーグラスをかけるなんてことがやられていましたが、ビニールテープやアルミフォイルなど（厚み／高さは重ねることで調整）を使うというのも、同業者の間では普通です。ビニールテープなら、スライドグラスの上にぺタッとはって、後から適当な大きさの窓をカッターで切り抜きます（口の字にするよりコの字か、口の字の一部に水路を切ったほうが、余剰のメディウムが逃がせるのでやりやすい）。

(無題) 削除/引用 No.1426-12 - 2009/11/15 (日) 22:44:30 - えんぶりお りんごさん 当方ではベクタシールドを使用していますよ これで１ヶ月くらいはもちますよ でもどうしてつぶしてはいけないのかがわかりません。 参考までに教えて下さい。

(無題) 削除/引用 No.1426-11 - 2009/11/10 (火) 15:45:02 - りんご なるほど＊＊！！ ドロップに入れたまま検鏡していらっしゃるんですね。 ということは一回観察したら保存はせずに捨てるということですか？ 私もカバーガラスではさむ時に、ドキドキしながら優しくのせています。 つぶれないようにprolong goldを少し多めにのせてはいます。 胚がひしゃげるのがカバーガラスをのせてからというよりは、 prolong goldに移した瞬間にひしゃげるのでやはりprolong goldの影響が大きい気がします。 私の研究室ではmounting mediumは使用していません。 やっぱり封入剤を変えた方がいいのかな…。 それかあかねさんがおっしゃるようにGlycerolで徐々に置換していくか。 ちなみにどちらのmounting mediumを使用されていますか？？？

(無題) 削除/引用 No.1426-10 - 2009/11/09 (月) 05:30:22 - あかね まず、当方では基本的には透明体を除去した状態でやっています。 それと、最後にカバーグラスで封入してしまうなら、プレパラートを作成した時点で胚の本来の形を維持することはできず、ガラスで押しつぶされた状態になっています。 なので、mounting mediumで変形するのを気にしてもいいですが、ガラスで押しつぶされることも気にしておくべきです。 Prolong goldやvectashieldなどの封入剤は80%程度のGlycerolが入っています。 そのせいで、Blastocystなどはいきなり封入剤にいれると形がヘシャゲてしまいます。 なので、10%, 20, 40, 60, 80 % Glycerolなどのdropで各15分くらいincubateしてやると、 最後のmounting mediumで形が変形することはありません。 この際、温めたドロップ(42℃）を使う方が、粘土が小さくなって変形がすくなくなります。 ちなみに当方では、プレパラートは作成せずに、mounting mediumのdropの中に胚を入れてそのまま3Dを維持した状態で検鏡しています。

(無題) 削除/引用 No.1426-9 - 2009/11/07 (土) 17:51:51 - りんご あかねさん、えんぶりおさん ありがとうございます＞＜。 agaroseでdishをコートや、各試薬にBSAを入れるなど、 先生に打診してみようと思います！！ これまで透明帯を除去して免疫染色をしていました。 お二方は透明帯を除去せずに行っているということでしたので、 BSAを添加などの前に、手っ取り早く透明帯を除去せずに 免疫染色を行ってみました。 何個かdishにくっつくものはあったものの、 最後の工程まで行うことができました＞＜！！！！ 本当にありがとうございました＞＜☆ ただサンプルが足りないので、 次はBSAを入れるなどしてもう一度実験をしたいと思います！！ ただ、最後にprolonged goldという封入剤で封入したところ、 胚が少しつぶれてしまいました；； うーーーん・・・。 免疫染色した胚を保存したいので、 最後の封入の際に、 スライドガラスの上に封入剤をのせ、 そこに胚を移し、 最後にカバーガラスをのせて封入しました！！ この方法で合っているのでしょうか？？ 胚の免疫染色のプロトコルなどのデータや本などを持っている方がいらっしゃいましたら、 題名など教えていただけないでしょうか；； 何度も何度もお手数をおかけしてすいません！！

(無題) 削除/引用 No.1426-8 - 2009/10/29 (木) 11:24:54 - p おいおい； 固定って何かわかっていらっしゃいます？ もしわかっていないなら、それはいかがなものかと。

(無題) 削除/引用 No.1426-7 - 2009/10/29 (木) 11:09:39 - hi すみません、どうしてPFA固定のときBSAを使ってはいけないのでしょうか？ 横道で、無知でごめんなさい…

(無題) 削除/引用 No.1426-6 - 2009/10/29 (木) 01:05:37 - えんぶりお あかねさんのおっしゃる通りPFAには入れてはいけません。 それ以外は入れてよいと思います。 ただし当研究室ではTriton Xで可溶化する際はBSAは入れていません。 濃度は0.1〜1.0％位で使ってますよ。溶かしたあとフィルターもかけています。 透明帯は試薬？酸性の溶液で溶かしてしまえばいいかとも思います。 論文を探すとちょくちょく載っていると思いますよ。 これもまたあかねさんのおっしゃる通り、除去は必ずしも行わなければならないというわけでもないとも思います。 現にわたくしは除去せずに免染しています。

(無題) 削除/引用 No.1426-5 - 2009/10/28 (水) 22:21:59 - あかね まず、透明体を維持したままでも、免疫染色は行えます。 透明体はスポンジのようなもんで、抗体なんかは透明体を通り抜けます。 透明体に非特異的な抗体の吸着がある場合もありますが、本来観察する細胞内と透明体とでは場所が全然違うので、あまり気にしなくてもいいかもしれません。 免疫染色の方法は人それぞれですが、ドロップに順次胚を移していく方法で構わないと思います。 私の場合はagarose でコーティングした96 well plateでやっています。 BSAやPVPは各試薬に入れてください。 もちろんPFA固定の際はBSAは入れてはいけません。 当方ではBSAは使っておらず、もっぱらPVPのみを胚の吸着阻害剤として使っています。 Good luck

(無題) 削除/引用 No.1426-4 - 2009/10/28 (水) 18:23:37 - りんご なるほど。そういう手があるのですね＞＜ 先生は透明帯を細いパスツールで傷をつけて 視力検査のCみたいにするんだ！ と言われたのですが、それはすごい技術がいるので･･･。 あと、免疫染色の各試薬のドロップを作っておいて、 これに胚を順次移して反応させると言われましたが、 この方法は正しいのでしょうか？？ BSAやPVPを入れるのは各試薬にですか？？ 忙しい中、親切に答えていただきありがとうございます＞＜ よろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.1426-3 - 2009/10/28 (水) 00:55:26 - えんぶりお BSAをいれるとくっつかなくなりますよ

(無題) 削除/引用 No.1426-2 - 2009/10/27 (火) 23:45:08 - あかね 1mg/mlのPVPを入れてみてください。 それか、1% Agaroseでdishをコートするとくっつかなくなると思います。

胚の免疫染色 削除/引用 No.1426-1 - 2009/10/27 (火) 22:06:56 - りんご 胚盤胞の免疫染色を行いました。 しかし、透明帯を除去するとnon-treated dishでも接着してしまい、 うまく操作ができません。 プロトコルを探したのですが、各試薬との反応時間は書いてあっても、 具体的に胚をどう扱ったかが書いてありません…；； どなたか胚の免疫染色のプロトコルを教えてください＞＜。

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