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(無題) 削除/引用 No.1419-9 - 2009/10/28 (水) 12:14:50 - Pumpkin >DMSO使用を前提でわざとTm値の高いprimerを作ることもあるのでしょうか？ そういった配慮をしたことはないですね。そういうことを考えるとDMSO添加であっても非特異的増幅を減らせるかもしれませんね。ただ、非特異的バンドが出ても、正しいバンドを切りだすという方向で行いますので、2~3本ほどの非特異的バンドが出ても、あまりに近接していなければ問題ないと考えています。 >Jumpstart-TaqはDMSOの濃度を5%以下にすることを推奨 Taqのfidelityがどのように下がるのか私も知りたいと思いましたが、あくまでミスリードが発生したという事実があるだけで、DMSOのせいなのか確率論なのかは断定できません。先程は断定した物言いになり申し訳ありません。 Taqは、pfu turboだったと記憶していますが、これも学生の頃の話で手元にノートがありませんので確かではありません。ただ、DMSO濃度に関しては10%混合で一律にしていました。ここの濃度はいじらず、アニーリング温度の加減でだいたいこなすようにしていました。 >効率の悪かったPCRが改善することで相対的にそのように見える そのように私も思います。

(無題) 削除/引用 No.1419-7 - 2009/10/28 (水) 11:56:57 - tm 私も「GC-richな鋳型の不都合な高次構造の解消」と認識しています．特にゲノムからのPCRでかかりにくい時にDMSOが有効だった経験があります（経験的にはどちらかというとDMSOよりMg2+濃度をふった方が効果的な気はしますが）． DMSOによって非特異バンドが抑えられるのではなくて，それまで効率の悪かったPCRが改善することで相対的にそのように見えるだけなんじゃないかと想像しています．経験的にはDMSOを加えると非特異的産物が増えるように思います．

DMSO 削除/引用 No.1419-6 - 2009/10/28 (水) 10:59:56 - Real-time 私もDMSOを入れて、思いもよらぬ長いサイズのエクストラバンドが出たことがあります。私は、鋳型のTm値が下がったり２次構造が解消されTargetとなるGC-richな配列が増加した結果、エクストラバンドが生じたと思っていました。 ところで、プライマーのTm値は下げすぎると増幅効率が落ちそうなのですが、DMSO使用を前提でわざとTm値の高いprimerを作ることもあるのでしょうか？ SIGMAのJumpstart-TaqはDMSOの濃度を5%以下にすることを推奨しています。PCRエラーが出たとのお話を聞くと、高濃度のDMSOでポリメラーゼのfidelityが下がることが心配ですが、DMSOとポリメラーゼのfidelityの関係をご存知のかたがいましたら、ご教示願えないでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1419-5 - 2009/10/28 (水) 10:20:13 - Pumpkin 私はats様のおっしゃる「GC-richな鋳型の不都合な高次構造の解消」にDMSO添加が有効だという認識と経験があります。 ですので、相対的にTm値を下げるわけですから非特異バンドが抑えられるというコメントには賛成できないのですが、皆様いかがでしょうか。私の経験では、GCリッチプロモーターのクローニングでDMSO添加で乗り切ったことがありますが、エキストラバンドは増えましたし、ものによってはPCRエラーも認められました。

(無題) 削除/引用 No.1419-4 - 2009/10/28 (水) 09:23:02 - ats GC-richなプライマーが目的部位以外にアニールしたり、「GC-richな鋳型の不都合な高次構造が伸長反応を阻害する（遅くする？）」ことを防ぐと理解しています。 DMSOを加えると二本鎖DNAのかい離温度も下がりますが、部分的に一本鎖のミスマッチ二本鎖DNAのかい離温度との差が開きミスマッチアニールが相対的に減少するのかな？ 確定的でなくてすいません。

(無題) 削除/引用 No.1419-3 - 2009/10/27 (火) 16:42:56 - 通りすがり >atsさん >ハイブリダイズするDNA(primerおよび鋳型）間の水素結合を弱めることにより、GCrichな鋳型の不都合な高次構造を防ぐ　 ということは、ちょっとずれてハイブリダイズすることを防いでいるという解釈でしょうか？ 　GCリッチな配列の場合に、通常ではバンドが見えず、DMSOを加えるとバンドが見えることがあるという記述を読んだことはあるのですが、それでは非特異的なバンドが消えるといったことはそれとは違う原理が働いているのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1419-2 - 2009/10/27 (火) 14:23:49 - ats おそらく、ハイブリダイズするDNA(primerおよび鋳型）間の水素結合を弱めることにより、GCrichな鋳型の不都合な高次構造を防ぐ、primerのアニール時の特異性を高めるためだと思います。

PCRにDMSO 削除/引用 No.1419-1 - 2009/10/27 (火) 14:13:47 - 通りすがり 　いつもお世話になっています。 　このフォーラムでもPCR時にDMSO溶液を添加すると、バンドが良く出る、非特異バンドが抑えられる等々の情報を読ませていただいて、実際にしてみると、良好な結果を得られたことがありました。 　しかしながら、この原理を、私なりに調べても分かりませんでした。このDMSOを用いることでPCRの結果が良好になる原理（理由）は分かっているのでしょうか？ 　ご存知の方、教えてください。

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