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(無題) 削除/引用 No.141-12 - 2009/03/10 (火) 15:43:00 - pei 本トピックの質問者です。 昨日、TBEバッファーを再調製し、機器についても汚れ等をふきとり 改めて、シーケンサーを動かしました。 結果、ピークが出現するまでの泳動時間も以前と同様になりました。 また、泳動時の電圧ですが、前回は12mAだったのが5mAと、マニュアル での通常値の範囲内（3-5mA）に収まっていました。 やはりバッファーが一番の要因だったと思われます。 みなさまのご親切なアドバイス大変感謝しております。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.141-11 - 2009/03/06 (金) 12:58:34 - pei みなさま、丁寧なご指導ありがとうございます。 今のところ、まずできることは、 １、バッファーを新しく作り直す（組成やpHなど注意して）。 ２、機械の漏れ関係をチャックする。 というような感じでしょうか。 来週の前半に以上を注意しながら、再度シーケンサーに かけたいと思います。機械の故障でないことを願います。

(無題) 削除/引用 No.141-10 - 2009/03/06 (金) 12:52:38 - AP たとえば同じ電圧でも、バッファーのイオン強度が高くなると電流は大きくなりますが、核酸の移動は遅くなります（よね？）。 ・バッファーが狂っていてイオン強度が不適切（TBEを塩酸などでpHしたとか、蒸発によって濃度があがっているとか、希釈率を間違えたとか）。 ・アクリルアミドや尿素が分解してイオンを生じている（pHが中性からずれるので、pHペーパーで調べてみるとわかるかも）。 などの可能性はどうでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.141-8 - 2009/03/06 (金) 12:31:03 - DSC ＞一知半解さま すみません、物理学的なことに無頓着なもので。ゲル・バッファーの抵抗値が一定のもとでの話ということで理解して頂ければよいかと。装置は基本的にCVですから、ゲルやバッファーに不備がなければ、下記の可能性を考えてよいですよね？

(無題) 削除/引用 No.141-7 - 2009/03/06 (金) 10:39:54 - 一知半解 「電流値が大きくなっているのならばDNA断片の泳動速度も速くなるはず」なのですか？　泳動速度は電圧（電場）の関数であって電流は関係ないのでは。

(無題) 削除/引用 No.141-6 - 2009/03/06 (金) 10:26:21 - DSC 単純に考えて、電流値が大きくなっているのならばDNA断片の泳動速度も速くなるはずです。逆に電流値が大きいにもかかわらず泳動速度が著しく遅くなっているのならば、ゲル以外の部分を電流が流れている（ショートしている）可能性があると思います。ハードウェア（またはゲル）に欠陥があるのでは？　GeneRapidは使ったことがありませんが、自分でスラブゲルを作製するタイプですよね？　同じタイプのABI PRISM377では、（１）アッパー（陰極側）バッファーチャンバーのゴムパッキンが劣化してバッファーが漏れたとき、（２）サンプルアプライ前のウェル洗浄時にチャンバーから溢れ出たバッファーがゲル板の脇側を伝って漏れていたとき、（３）ゲル作製時にゲル液がゲル板の端側に漏れ出していたときに同じような症状が出ていました。漏れが大きいとエラーで停止していましたが。

(無題) 削除/引用 No.141-3 - 2009/03/05 (木) 21:43:12 - pei yamaさん、早速のお返事ありがとうございます。 バッファーですが、3週間ほどたったものを用いました。 来週、新しく作ってみます。 ちなみに、古くなると移動度など問題になってきたりするのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.141-2 - 2009/03/05 (木) 20:17:57 - yama ゲルに問題がないとすると バッファーについてはどうですか？ 毎回新しい物をお使いでしょうか？

シーケンサーでのピークの出現がおそくなった 削除/引用 No.141-1 - 2009/03/05 (木) 18:37:35 - pei 今、私どもは細菌由来の16SrRNAをDGGEで分離し、遺伝子配列（200bp程度）をDNAシークエンサー（Gene Rapid sequencer，GEヘルスケアバイオサイエンス（旧アマシャムバイオサイエンス）製）を用いて解析しようとしています。 ところが本日問題が発生しました。 これまでも同機械を用いて遺伝子配列解析を行っていたのですが、電圧をかけてから始めのプライマー等と思われるピークが出現するまでの時間が、これまでよりも３倍くらいおそくなったとともに、その後の配列のピークも不明瞭です。 もともと本装置では200-300bpくらいの長さの配列をよんでいたのですが、これまでの200bpくらいのピークの出現の位置に始めのピークが出るくらいです。 ゲルの調製等は、以前と変わらないつもりではやっています。 ただ気になるのは、ゲルにかける電圧は同じなのですが、電流がマニュアルだと 3-5mA程度とかかれているところ、12mA程度の値になってます。 以前の値は覚えていません。 なにか情報がありましたら、申し訳ありませんが教えてください。 よろしくおねがいします。

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