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御礼 削除/引用 No.1409-6 - 2009/10/27 (火) 13:20:53 - DNAの蛍光標識 皆様 ご多用の中、有難うございました 御礼まで

(無題) 削除/引用 No.1409-5 - 2009/10/26 (月) 23:17:44 - AP えーと、 末端といっても3'でいいのか、どうしても5'にしたいのか？ 3'なら最初のレスの方法が第一選択でいいと思います。 5'なら、次のレスにあるように「5'標識のプライマーをオーダーして」つまりプライマー合成の時に5'末端に標識を入れてもらって（たいていのメーカーでプラス数千〜1万円くらいでやってくれます）、PCRに使えばいいんです。 一本鎖標識もこの方法でできます。たとえば、片側の標識プライマーだけでPCRをかけるとか。厳密にはPCRではないですが、たとえば30サイクルまわせば、導入した鋳型の30倍の標識一本鎖が得られ、非標識の鋳型はたいていの目的で無視できます。また、鋳型鎖を十分に長く設定して、プライマーアニーリングサイトが中間にくるようにすれば、産物が鋳型より鎖長が短くなるので、変性ゲルで分離精製できるでしょう。 あるいは、コスト度外視でもいいからきれいにやりたいなら、片側のプライマーを末端蛍光標識、もう一方を末端ビオチン標識にしてPCRをかければ、産物を一本鎖に解離してビオチン末端を持つ鎖だけをアビジンビーズなどで除去することもできるでしょう。

(無題) 削除/引用 No.1409-4 - 2009/10/26 (月) 22:31:07 - DNAの蛍光標識 早速のご返答有難うございます ＤＮＡ二重鎖の場合、どうしても末端に付けたいのですが ＰＣＲで蛍光ヌクレオチドを使用すると末端だけ 標識するのは困難だと思うのですが・・・ ご教授お願いします

(無題) 削除/引用 No.1409-3 - 2009/10/26 (月) 21:51:27 - AP ああ、どちらの方法も3'末端の標識になりますが、ほとんどの目的でそれで大丈夫だと思います。使用目的はなんでしょうね。どうしても、5'標識が必要なら、たとえば5'標識のプライマーをオーダーして、PCRベースで作るのがいいと思います）。

(無題) 削除/引用 No.1409-2 - 2009/10/26 (月) 21:46:23 - AP どちらも、TdT (terminal deoxyribonucleotidyl transferase)で3'末端に標識dNTPまたはddNTPを付加するのが簡便、かつ一般的だと思います。TdTと標識dUTPとかddUTPでもバラで購入すればできます。 二本鎖の場合は、制限酵素切断などで末端を5'突出にしておいて、klenowでfill-inするときに標識dNTPを取り込ませるのが確実で楽だと思います。 bluntingと同様の反応ですが、完全にbluntにする必要はなくて、たとえば -AATT-5'の突出末端には標識dUTPのみ加えて、Aに相補の部分だけ伸ばせばいいです。 >一本鎖の場合、蛍光標識されたオリゴＤＮＡと蛍光標識したいＤＮＡを酵素反応でくっつけるのがベストでしょうか？ 不可能ではないですが、一本鎖DNAを効率よくｌigationする系はないですから、あんまりよいアイデアではないと思います。

ＤＮＡの蛍光標識 削除/引用 No.1409-1 - 2009/10/26 (月) 20:55:07 - DNAの蛍光標識 DNA(一本鎖、二本鎖）の末端に蛍光分子を標識しようと思っています 一本鎖の場合、蛍光標識されたオリゴＤＮＡと蛍光標識したいＤＮＡを酵素反応でくっつけるのがベストでしょうか？ また、二本鎖の場合はどういう方法がいいのでしょうか 教えてください また、お勧めの試薬があれば教えてください

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