お世話になります。
どうか、みなさまのご意見、アドバイスいただけないでしょうか、
よろしくお願いいたします。
現在、Sf9 insect cellsに可溶性タンパクを発現させました。
培養上清は無血清SF900-IIです。
その培養上清を（濃縮せず）SDS-PAGE後、Hisタグに対する抗体やV5に対する抗体でIBした結果、ちゃんとタンパクが発現していることが確認されました。
このタンパクは別のlabでも作成されており、そこではNi-NTAカラムを用いてaffinity精製を行っているということから、私どもの研究室においてもそれにならって、Ni-NTAカラムを利用しました。
ところが多くのタンパクがFlow throughに来てしまい、一応、高濃度Imidazoleで溶出はされるのですが、わずかしか（CBB染色でも確認できないほど）精製できませんでした。Hisタグに対してIB行うと確かに高濃度imidazoleで溶出が確認できました。
pHが重要かと考えまして、培養上清のpHを測定するとpH6を示しておりましたので、wash bufferやbinding bufferのそれと合わせた方が良いだろうと考え、1M Tris-HClでpHを7.9に上げました。
するとそのタンパクの等電点がpH8付近なのか、タンパクが凝集してしまいました。
非常に素人的な質問で大変恐縮でみっともありませんが、どうかみなさま問題点など指摘していただけないでしょうか？
どうぞよろしくお願いいたします。 |
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