Bio Technical フォーラム

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b-actinバンドがうまくでません。 トピック削除
No.1404-TOPIC - 2009/10/26 (月) 12:45:24 - 初心者
はじめまして。
研究を始めて２年の大学院生です。

脂肪細胞について、RT-PCRとreal-time PCRを行っています。

しかし、内部標準として使用しているb-actinのバンドがRT-PCRでは薄く、
real time PCRでは検出限界以下でした。
real time PCRのstandardは立ちあがっています。

RNA産物が壊れているのかもしれないと思い、
total RNAを電気泳動したところ、28s,18s,5sのバンドが確認できました。

RTはRNA産物2μgを用いて
denature;70℃、5min
⇓
MMLVを用いてRT
20℃ 10min
37℃ 60min
95℃ 5min
を行っています。

研究室内の人々は、同様の方法・試薬を用いてb-actinのバンドを確認できています。

手技の問題以外に、内部標準のバンドが出ない理由がありましたら教えていただけないでしょうか？

御忙しい中とは存じますが、どうぞよろしくお願い致します。
　
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No.1404-5 - 2009/10/26 (月) 17:58:08 - 初心者
み 様

御忙しい中、御返事を下さってどうもありがとうございます!!!!
本当に助かります。

●脂肪細胞とはcell lineですか？
　動物由来の白色脂肪組織ですか？

>>脂肪細胞は、マウス由来の白色脂肪組織です。
　皮下脂肪組織です。


●あなたが精製されたRNAの純度は問題ないですか（260/280など)？

>>260/280のRNA純度はDEPC希釈で1.5前後でした。
（過去のBio technicalフォーラムで、DEPC希釈では260/280が低値を示すと書いてありましたが、私の研究室ではDEPC希釈を昔から260/280を測るために使用しているようです。）

●脂肪滴の混入がひどいようなら、精製を２回繰返すなどの工夫が必要かも。

>>脂肪滴の混入はできるだけ除くために、精製は2回繰り返しました。


●白色脂肪は体積あたりの細胞数が少ないので収量は凄く少ないはずです(少　ないと言ってもRT-PCRなんて1マイクログラムあれば可能なのですがね）。
　cell lineならそのあたりは問題なく行けると思いますが。

>>OD260は、0.3〜0.6でした。
　核酸は取れていると思うのですが。。。


●あなたの手技は、脂肪細胞以外のポピュラーの細胞・組織からのRNA精製、　RT-PCRに問題ないのでしょうか？
　この辺のコントロールを取りながら周りの人に見てもらえばクリアーでき　ると思いますが・・・。

>>やはり、手技的な問題が一番疑わしいですよね。
　1年前にRT-PCRを行ったときは、うまくいったのですが、
　今回やってみるとなかなかうまくいかなくて・・・。
　他の臓器でもう一度やってみます！！


もし何か思い浮かぶことがありましたら、何でも教えてください。
どうぞ、よろしくお願い致します。

(無題) 削除/引用
No.1404-4 - 2009/10/26 (月) 15:41:25 - み
脂肪細胞とはcell lineですか？
動物由来の白色脂肪組織ですか？
あなたが精製されたRNAの純度は問題ないですか（260/280など)？
脂肪滴の混入がひどいようなら、精製を２回繰返すなどの工夫が必要かも。
白色脂肪は体積あたりの細胞数が少ないので収量は凄く少ないはずです(少ないと言ってもRT-PCRなんて1マイクログラムあれば可能なのですがね）。
cell lineならそのあたりは問題なく行けると思いますが。

あなたの手技は、脂肪細胞以外のポピュラーの細胞・組織からのRNA精製、RT-PCRに問題ないのでしょうか？
この辺のコントロールを取りながら周りの人に見てもらえばクリアーできると思いますが・・・。

(無題) 削除/引用
No.1404-3 - 2009/10/26 (月) 15:31:26 - 初心者
み　様

御返事ありがとうございます。
研究室の方々の御力も借りているのですが、
全員、行き詰ってしまいました。
そこで、このトピックを作らさせて頂きました。

もし、何か御考えがありましたら、
教えて頂けたら幸いです。

(無題) 削除/引用
No.1404-2 - 2009/10/26 (月) 12:51:15 - み
>[Re:1] 初心者さんは書きました :
> 研究室内の人々は、同様の方法・試薬を用いてb-actinのバンドを確認できています。

研究室内の人々にお聞きになれば良いでしょう。
大学院生は教育を受ける権利があります。

b-actinバンドがうまくでません。 削除/引用
No.1404-1 - 2009/10/26 (月) 12:45:24 - 初心者
はじめまして。
研究を始めて２年の大学院生です。

脂肪細胞について、RT-PCRとreal-time PCRを行っています。

しかし、内部標準として使用しているb-actinのバンドがRT-PCRでは薄く、
real time PCRでは検出限界以下でした。
real time PCRのstandardは立ちあがっています。

RNA産物が壊れているのかもしれないと思い、
total RNAを電気泳動したところ、28s,18s,5sのバンドが確認できました。

RTはRNA産物2μgを用いて
denature;70℃、5min
⇓
MMLVを用いてRT
20℃ 10min
37℃ 60min
95℃ 5min
を行っています。

研究室内の人々は、同様の方法・試薬を用いてb-actinのバンドを確認できています。

手技の問題以外に、内部標準のバンドが出ない理由がありましたら教えていただけないでしょうか？

御忙しい中とは存じますが、どうぞよろしくお願い致します。
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