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(無題) 削除/引用 No.1402-8 - 2009/10/30 (金) 08:59:41 - ~ まず、その生えてきた大腸菌に入っているベクターは本当にpGEM-T easyなのでしょうか？ PCR後に精製していないpEGFP-C3がトランスフォーメーションに持ち込まれ、 それが生えてきただけということもあるかと… とりあえず数クローンずつミニプレップして、EcoRIなどで切ってみてはいかがでしょうか。 傾向はつかめると思います。

(無題) 削除/引用 No.1402-7 - 2009/10/29 (木) 23:29:53 - クローニング 皆様 お返事が遅くなり申し訳ございませんでした。 実際にterminator有りと無しで両方やってみましたが、両方ともカナマイシン耐性コロニーが生えて来ました。一方で、アンピシリンのほうにはコロニーが全く観察されません。これはいったいどういうわけなのでしょう？ 心当たりがありましたら、お教えいただきたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.1402-6 - 2009/10/26 (月) 09:08:09 - おお >[Re:5] ~さんは書きました : > 素人考えですが、向きが合えばlacZのターミネーターが使えるのかもしれませんね。 あ、そうですねpGEMはマルチクローニングサイトにLacZをオーバーラップさせて いるということですね。それなら十分可能性があります。考えがおよびませんでした。

(無題) 削除/引用 No.1402-5 - 2009/10/25 (日) 15:48:26 - ~ 素人考えですが、向きが合えばlacZのターミネーターが使えるのかもしれませんね。 さらに切り出して使うときにどうなるのかは分かりませんが。

(無題) 削除/引用 No.1402-4 - 2009/10/25 (日) 06:32:46 - おお >[Re:3] クローニングさんは書きました : > おお様 > > お返事どうもありがとうございます。 > ところでターミネーターの有無は転写効率にかなり影響するのでしょうか。 正直バクテリアの発現については詳しく分かりません。 ターミネーターがないと確か転写はプラスミドをずーっと ぐるぐる回っている状態になり得ますので、場合によっては あまりよくないかと、、、 マンマルとかのようにポリAはつかないので安定性という意味では マンマルほど気にしなくていいかと思いますけど (バクテリアなどはポリAは分解シグナルになったりするそうですが)。

(無題) 削除/引用 No.1402-3 - 2009/10/25 (日) 06:25:25 - クローニング おお様 お返事どうもありがとうございます。 ところでターミネーターの有無は転写効率にかなり影響するのでしょうか。 今回の場合ですと https://www.lablife.org/ct?a=viewvecseq&soid=349&view=Draw&f=v にありますように3592-3861がTerminatorとなると思います。 どの程度必要であるのか、この分野には詳しくないためわかりかねますが、おそらくこの部分を含んだほうが良いのでしょうね。

(無題) 削除/引用 No.1402-2 - 2009/10/25 (日) 05:45:36 - おお バクテリアのプロモーターを含んでますので、理論的には発現します。 ですのでカナマイシン耐性を獲得する可能性はあります。 ストップコドンから数ベースのところまでしかとってないので、 ターミネーターが含んでないかもしれませんね。どこにあるんでしょうか ターミネーターは、、、なくても機能する可能性はたかいですけど、、、

カナマイシン耐性遺伝子のサブクローニング 削除/引用 No.1402-1 - 2009/10/25 (日) 02:00:18 - クローニング 現在アンピシリン耐性遺伝子を持つ、pGEM-T easyベクターにカナマイシン耐性遺伝子をTAクローニングしようとしています。 カナマイシン耐性遺伝子はClontechのpEGFP-C3から、Ampプロモーター、SV40 early promoterおよびNeo/KanORFを含む領域をPCRで得た後、TAクローニングする予定です。 実際には http://www.clontech.com/images/pt/dis_vectors/PT3052-5.pdf の2141-3421の領域を増幅しようとしています。 こうして得られたPositive cloneは、AmpicilinでもKanamycinでもスクリーニングできると考えているのですが、いかがでしょうか。

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