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(無題) 削除/引用 No.1401-7 - 2009/10/25 (日) 06:26:06 - おお >[Re:6] vさんは書きました : > 問題は無いのですね、ありがとうございます。 > > ただ環状プラスミドがランダムに切れるということは発現量に影響を与えそうですね その可能性はありますね。 例えば耐性クローンをシングルクローンから拾っていくと、 それぞれ発現量、コピーナンバーなどそれぞれ違います。 サザンブロットをしてもパターンが違い、アクシデンタル な部分が多いことを物語っています。 リニアーにして入れることにより、発現ユニットにプレイク を起こさず挿入しようという考えはあるようです。 しかしながら、すべてに置いてその様にうまく行くかというと 答えを持ち得ません。

(無題) 削除/引用 No.1401-6 - 2009/10/24 (土) 18:58:38 - v 問題は無いのですね、ありがとうございます。 ただ環状プラスミドがランダムに切れるということは発現量に影響を与えそうですね

(無題) 削除/引用 No.1401-5 - 2009/10/24 (土) 11:25:33 - おお >[Re:1] vさんは書きました : > また、もし環状のプラスミドが組み込まれるのならばプラスミドのどこかでランダムに切断されると思うのですが、切断されるメカニズムがわかりません。 そうそう、 想像では内在性DNaseなどのアタックでアクシデンタル なもので、なにか生理的メカニズムによるものでは ないようなきがしてます.

(無題) 削除/引用 No.1401-4 - 2009/10/24 (土) 11:13:19 - おお わたしもメカニズムは分かりませんのでコメントを 書かなかったのですが、転写が盛んな所に組み込まれる 傾向があるようです。 なので転写時に働く遺伝子修復機構は関与しているかもしれません。 それか、単に転写が抑制されているところに入っても、周りからの 抑制機構によってマーカーとか発現しにくく、結局セレクション で落ちていくのかもしれませんが、、、、、 環状でもリニアーでも取り込まれますね。 環状でトランスフェクションして何%が環状ののままいられるんだろうか という気もします。リニアーでいれるのは理由がある事がありますが、 大抵はどちらでもOKかなと思います。

(無題) 削除/引用 No.1401-3 - 2009/10/24 (土) 11:03:13 - NEKO メカニズムは知りませんが、環状でも組み込まれます。 少しでも組み込まれる確立をあげるために、制限酵素で切断したプラスミドをトランスフェクションする人もいます。

(無題) 削除/引用 No.1401-2 - 2009/10/24 (土) 10:58:26 - ~ メカニズムは分かりませんが。 >プラスミドは環状のものを用いても細胞の遺伝子に組み込まれるのでしょうか？ はい。

環状のプラスミドを用いたトランスフェクト 削除/引用 No.1401-1 - 2009/10/24 (土) 10:45:25 - v リポフェクション法による細胞の安定形質転換を行おうと思っております。 基礎的なことですがここで質問をさせてください。 stable cellは細胞の核内に侵入し、ゲノムにプラスミドが組み込まれて発現する細胞であるというのはわかりますが、プラスミドは環状のものを用いても細胞の遺伝子に組み込まれるのでしょうか？ また、もし環状のプラスミドが組み込まれるのならばプラスミドのどこかでランダムに切断されると思うのですが、切断されるメカニズムがわかりません。 ご存じの方はどなたか お教えください。ご返信お待ちしています。

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