全7件 ( 1 〜 7 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.1400-7 - 2009/10/25 (日) 06:19:16 - おお ノックダウンの実験にこだわり過ぎているのではと思います。 たしかにoff targetの可能性を示すには複数のsiRNAで 示せますし、過剰発現によるレスキューが実験系として成り立たないなら そこでごちゃごちゃいじっていても得るものが少ないかもしれません。 お示しの例であれば(あなたの実際の実験のヒントになるかはわかりませんが) カスペース8の活性化とインヒビターを用いた細胞し抑制、カスペース8とFASの 結合など証明できる実験がいっぱいあると思います。 でもどうしてもというならESやECなどホモロガスリコンビネーションの頻度が たかい細胞で、目的の遺伝子をsiRNA耐性の遺伝子にすり替えてしまうては あると思います。 FASを回した誘導のような実験であれば安定導入で増えてきてFASの感受性 があれば何とかなるのではないでしょうか?その場合はコントロールとして siRNA耐性と同時に耐性でないコンストラクトでクローンをひろう必要が あるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.1400-6 - 2009/10/24 (土) 22:54:04 - heimlich こうゆう場合、dominant negativeで同じ結果が出るということを示すのではだめなのでしょうか？ off target効果を否定したいなら、siRNA以外の方法で示せばというのは単純ですかね？

(無題) 削除/引用 No.1400-5 - 2009/10/24 (土) 20:30:34 - み >[Re:4] レスキューコントロールさんは書きました : > 次に、上記の表現型がsiRNAによるサイドエフェクトでないことを証明しなければなりません。 siRNA配列に関してコントロールとれば良いだけでしょ。 parent細胞, control-siRNA, caspase8-siRNA #1, caspase8-siRNA #2 を比較する。

(無題) 削除/引用 No.1400-4 - 2009/10/24 (土) 18:35:10 - レスキューコントロール コメントありがとうございました。もう少し具体的な話をします。 例えばFasにより誘導される細胞死にCaspase-8が重要かどうかをノックダウンを用いた方法で証明しようとします。 細胞にCaspase-8に対するsiRNAを導入した細胞ではコントロールsiRNA導入細胞と比較して、Fas依存性の細胞死が抑制されたので、Caspase-8はFas依存性細胞死に重要であることが証明できたとしましょう。 次に、上記の表現型がsiRNAによるサイドエフェクトでないことを証明しなければなりません。 その一つの方法として、用いたsiRNAにより発現抑制されないよう変異を入れたコンストラクト「Caspase-8'」を発現する細胞を作製して、この細胞にsiRNAを導入しても細胞死が誘導されることを示す方法が考えられます(いわゆるノックダウン系でのレスキュー試験)。 しかし、Caspse-8'を発現誘導するだけで細胞死が誘導されてしまうので、Fas刺激を加える前に細胞が死んでしまいます。 こういった場合、みなさんはどのように証明しますか？ 例えばレスキュー試験ではなくて、複数のsiRNAを作製して同様の結果であることを証明する、とかCaspase-8以外のFasシグナルタンパク質(FADDとかCasp3など)の発現は用いたsiRNAによって変化を受けていないという証明が考え付きますが、もう少しエレガントな証明方法はないものかと思い質問しました。

(無題) 削除/引用 No.1400-3 - 2009/10/24 (土) 10:16:21 - おお 細胞死誘導シグナル関連因子の方をtetなどの誘導性にする。 shRNAのを誘導性プロモーターを使った安定導入株を樹立する。 shRNAの安定発現株を2種類(ネガコンとターゲットノックダウン)をよういする。 あまり革新的なアイデアではありませんけどね。 色々な問題点を指摘しているのですが、ちょっと何が聞きたいのか つかめませんが、、、、

(無題) 削除/引用 No.1400-2 - 2009/10/24 (土) 10:04:34 - レスキューコントロール >複数のsiRNAを使うという方法以外の方法もありますが... は 複数のsiRNAを使うという方法以外の方法は考えられるでしょうか？ の間違いです。

細胞死関連因子に対するsiRNAにおけるレスキュー試験 削除/引用 No.1400-1 - 2009/10/24 (土) 10:02:10 - レスキューコントロール siRNAを使ったノックダウン法によるタンパク質の機能解析はよく行われておりますが、一方でsiRNAによるサイドエフェクトの問題が良く取りざたされます。 これの対応として、siRNAがターゲットとするmRNA配列に、アミノ酸配列の変換が行わないように変異を導入したプラスミドを作製、これを用いてレスキュー試験を行うことがあるかと思いますがターゲット因子によってはこれが困難な場合があるかと思います。 例えば、ある細胞死誘導シグナル関連因子の場合、往々にして発現を誘導するとそれだけで細胞死が誘導されてしまうのでレスキュー試験を行う為の安定発現細胞を得ることが出来ません。 一過性発現で生き残った細胞を用いて解析を行うとして、しかしこれはその因子を介した細胞死シグナルに対して感受性の低い細胞を選択しているのと同義である点で疑問が残ります。 みなさんはこのような状況の場合、レスキュー試験をどのように行いますか？ 複数のsiRNAを使うという方法以外の方法もありますが...

全7件 ( 1 〜 7 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

---