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(無題) 削除/引用 No.1397-6 - 2009/10/23 (金) 19:29:24 - A 皆様、コメントありがとうございます。 ＞うさま 最初に凍結切片を連続的にまとめて取りました。 その切片を使用して、染まらない、少し染まった、前回と同等に染まった と言ったバラバラとした結果となりました。 凍結切片を採取した条件は同じだと考え、その部分には問題がないのでは、と思った次第です。 切片採取１枚１枚に条件が違う、となれば、切片に問題があるのかもしれません。 ＞みさま 一応、連続切片をまとめて採取しました。 上記同様、１枚ごとにアーチファクトを考慮しなければならないということですね。 切片採取もかなり重要（決して適当にはしていません）だということですね。 ＞うさま（↑同じうさまでしょうか。） 連続的な切片です。 以前に見られた反応性は、予想されたものだと評価されたので、今回は以前と同じサンプルと新しいサンプルを染色しました。 以前と同じサンプルをいわばポジコンとして置きました。 以前と同じサンプルは長期保管（１ヶ月くらい）したものですが、今回改めて薄切した切片で、バラバラした結果となってしまいました。 今回、全て染まらなければ、凍結ブロックが古くなった、など考えられたのですが、染まった時があったので原因が分からなくなりました。 ＞組織さま 界面活性剤はそれほど問題にはならないのですね。 まず、1次抗体は分注して凍結しています。 毎回、新しいものを希釈して使用しています。 サンプルは新鮮凍結したものなので、薄切後に冷風乾燥した後、アセトンで固定しています。 みなさま、いろいろとコメントをありがとうございました。 もう少し、検討をしてみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.1397-5 - 2009/10/23 (金) 13:33:40 - 組織 凍結切片の免疫染色で界面活性剤が問題になったことはないですね。むしろ固定とか一次抗体とかもっとクリティカルなところに問題があるような気がします。 未固定切片だとすると、固定はどうやってますか？ 一次抗体は毎回、分注・凍結したストックから使ってますか？

(無題) 削除/引用 No.1397-4 - 2009/10/23 (金) 13:22:57 - う つまり、状況が思い浮かばないので。 連続切片で確かめたのか？ （組織にあるターゲットになる細胞の分布とかとの関係性などなど） サンプルは以前のやつを長期間保存していたりしていないのか？ などなどなど。

(無題) 削除/引用 No.1397-3 - 2009/10/23 (金) 13:22:40 - み 凍結切片はスライドガラスへの貼り付き方(貼り付け方）でartifact拾う時もあれば、逆に陽性シグナルが得られない時もあるのでは？

(無題) 削除/引用 No.1397-2 - 2009/10/23 (金) 13:19:13 - う ＞同じ時にまとめて薄切したものを使用し、その中でも染まったり染まらないことが起きています。 （切片の新しい古いではなさそうです。） 何故そう思われるのでしょうか？ ここが一番疑われるところなのでそう思った根拠を示すのは重要かと思います。

免疫染色の再現性 削除/引用 No.1397-1 - 2009/10/23 (金) 13:04:48 - A 凍結切片で免疫染色をしているのですが、ある時期に染色条件の検討を行い、予想された反応性が得られ、再現性も得られました。 １ヶ月くらいして同じ染色法で染色を行ったのですが、反応性がほとんど得られない結果となってしましました。 その後、何度か同じ方法や凍結切片の再薄切、試薬の見直し、など行いましたが、染まったり、染まらなかったりして、改善できていません。 凍結切片は、同じ時にまとめて薄切したものを使用し、その中でも染まったり染まらないことが起きています。 （切片の新しい古いではなさそうです。） 洗浄バッファーの界面活性剤を通常Tween20を0.01%で添加しているのですが、凍結切片における反応性に影響を及ぼす可能性はあるのでしょうか。 Tweenの添加濃度を高くしたり、無添加でも試みたのですが、再現性は得られませんでした。 染色方法の中で原因がありそうなのですが、全く分からない状況です。 何か考えられることがあれば、ご教授のほどお願いします。

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