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(無題) 削除/引用 No.1393-8 - 2009/10/27 (火) 22:32:08 - + >なるほど・・・ DNAの比率をもう少し上げてみようと思います。 使用するDNAによってもどの比率が入りやすいとかあるとは思いますので、そのあたりは濃度をふってどれが一番いいのか探す等してくださいね。

(無題) 削除/引用 No.1393-7 - 2009/10/27 (火) 10:57:51 - たかし qqさん 詳細なプロトコルを提供していただきありがとうございます。 目的遺伝子に細胞毒性がないことは確認しています。 セレクションを始めるタイミングと 培地交換の頻度が私と大きく異なる点でしょうか。 細胞をスプリットと同時ではなく、しばらく培養した後セレクションを初めてみようと思います。 どうもありがとうございました。 unknownさん 貴重なコメントどうもありがとうございます。 ＞DNA：pOG44＝1:6が一番効率いいような気がしました。1:9では個人的にはあまりいい思い出が無いです・・・ なるほど・・・ DNAの比率をもう少し上げてみようと思います。 ＞１．一度ハイグロ無しの培地に継代 ＞２．60〜70%程度増えるまで待ち、育ってきたところでハイグロ入り培地に培地交換 ＞３．様子を見ながら継代or培地交換 やはり、ハイグロマイシン無しでしばらく培養した方がよいようですね。

(無題) 削除/引用 No.1393-6 - 2009/10/27 (火) 01:03:52 - + 私も3T3とPEIを使ってFlp-inで遺伝子を二つ入れていました。経験的なものですが、DNA：pOG44＝1:6が一番効率いいような気がしました。1:9では個人的にはあまりいい思い出が無いです・・・ 私のトランスフェクション後のプロトコルは、 １．一度ハイグロ無しの培地に継代 ２．60〜70%程度増えるまで待ち、育ってきたところでハイグロ入り培地に培地交換 ３．様子を見ながら継代or培地交換 これで細胞株を樹立していました。

(無題) 削除/引用 No.1393-5 - 2009/10/26 (月) 15:42:21 - qq 予め、flpin293細胞をZeo-freeで1回継代し、トランスフェクション用に捲き込みます。 3cm-dish subconfluentのflpin293に0.5ugずつのpcDNA5-gene-FRTとpOG44をトランスフェクションします。（３T３だと5-cm-dishで同じ細胞数程度でしょうか） トランスフェクション用培地に二つのDNAをmixして、10min放置して、 DNA液にplus試薬を添加して放置、Lipoを別の培地に添加して放置、 DNA-Plus-培地とLipo-培地をmixして更に15min放置です。 以上のmixを細胞にトランスフェクトしています。 24時間後に、10cm-dishに全部捲き込み、その1/10をもう一枚の10cm-dishに捲き込みます。 day3から、Hygromycin（50ug/ml）を添加して2週間程度、選択します。選択中の培地交換は、あまり頻繁に行うべきではありません。生存している細胞数に依存しますが、最初、day6で一回、次にday12でもう一回で良いかもしれません。 同時に、pOG44だけのトランスフェクションを行うのは悪くないコントロールです。こいつをゆっくりと完全に殺してしまうように、Hygroを入れていくと良いわけです。 また、pcDNA5-gene-FRTのHygroは、FRT組み換えで発現可能になるようになっているので、pOG44を入れないで目的遺伝子のDNAだけをトランスフェクトしても、それも結構なコントロールになります。 培地交換の日程は、培地の色や細胞を観察しながら決めてください。 薄い方か濃い方のディッシュいずれかから、６コロニーをピックして、XーGal陰性、遺伝子発現を確認して選択します。X-Gal陽性のクローンは、捨ててしまいます。 経験的にX-Gal陰性のコロニー間で遺伝子発現の強弱はほとんどありませんから、良いクローンを拾うことは可能ですが、より良いクローンを得ることは出来ません。 遺伝子がtoxicでなければ、20-200 colony/10cm-dishは、出てくるように感じています。 私の場合、flpin-TRexで入れているので、toxicの問題は無い（はずな）のですが、あなたの見たい遺伝子を一過性発現でtoxicかどうか見てみられると宜しいです。toxicな遺伝子だと、安定発現株は取れてきませんので、誘導発現系が必要になります。

(無題) 削除/引用 No.1393-3 - 2009/10/26 (月) 12:18:25 - たかし qqさんコメントありがとうございます。 > と書いてあるように思いますが、１：１でやって、そこそこ出てきます。 > PEIよりも、Lipofectamine+Plusのような、デンドリマー系でやる方が、コトラの確率が上がりそうな気がします。 比率はmanual通り１：９でやっていたのですが、１：１でも大丈夫なようですね。 デンドリマー系のトランスフェクション試薬も検討してみたいと思います。 Flp-in Systemではどの程度の効率でstableが樹立できるのでしょうか？ stable作りは初めての為、感覚が全くわかりません。 qqさんの２９３の例をお教えいただけませんか？ > ところで親細胞は、すべてX-Galで青く染まりますよね？ 起こしたばかりの細胞ということでノーチェックでした。 確認してみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.1393-2 - 2009/10/25 (日) 14:54:29 - qq 293でしかやった事がないのですが、 >�A24時間後、Flp-In 用発現ベクターとFlpリコンビナーゼ発現 >ベクターpOG44を1:9（ｗ/w）の割合で と書いてあるように思いますが、１：１でやって、そこそこ出てきます。 PEIよりも、Lipofectamine+Plusのような、デンドリマー系でやる方が、コトラの確率が上がりそうな気がします。 ところで親細胞は、すべてX-Galで青く染まりますよね？ 単純なstable作りの時でも、swiss3T3は難しい感触はありますね。

Flp-In Systemを用いた効率的にで安定発現株樹立 削除/引用 No.1393-1 - 2009/10/22 (木) 22:46:50 - たかし InvitrogenのFlp-In systemを用いて安定発現株の樹立を試みています。 プロトコルは以下の通りです。 �@Flp-In 3T3細胞を6ウェルプレートにまく（抗生物質不含培地） �A24時間後、Flp-In 用発現ベクターとFlpリコンビナーゼ発現ベクターpOG44を1:9（ｗ/w）の割合で ＰＥＩを用いてコトランスフェクション（トランスフェクション効率は正確には見積もっていませんが約３０％程度です） �B24時間後、 抗生物質含有培地に交換 �C24時間後、２５％コンフルエントになるようにまきかえ（６ウェル）、ハイグロマイシン含有培地（10~50ug/ml）で選択開始。 �D以降、3日おきに培地を交換 1週間ほどで通常のFlp-In 3T3細胞は30ug/ml以上のハイグロマイシン濃度で全て死滅しますが、 コトランスフェクションした細胞もそのほとんどが死滅してしまいます。 非常に増殖の悪いコロニーが１ウェルあたり1つとれるものもありますが、目的のたんぱく質は発現していませんでした。 そこで質問なのですが 効率的にで安定発現株をとるにはどうすればよいでしょうか？ １つ気になっている点としてFlpリコンビナーゼの発現量があります。 Flp-In 3T3細胞ではＣＭＶプロモーターがダウンレギュレートされているとのことですが、 pOG44のFlpリコンビナーゼはＣＭＶプロモーター制御となっています。 そのため、Flp-In 3T3細胞ではFlpリコンビナーゼの発現が低く、組み換え効率の低下を招いている可能性はないでしょうか？ （ただ他の論文ではpOG44でうまくいっているので気にする必要はないかもしれませんが） 同様な系で安定発現株の樹立をしたことがある方、何かアドバイスを頂けると大変助かります。

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