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(無題) 削除/引用 No.1390-10 - 2009/10/23 (金) 13:26:02 - AP >in vitroの系は使ったこと無いのですが、興味あります。発現量が十分なら是非使ってみたいですね。 市販品だとロシュのRTSシステムがよかったです。一反応(5ｍLくらい？）でmg オーダーの収量も可能です。高いですが。 原理的にはCECF (continuous-exchange cell-free) systemというやつで、反応槽と、拡散によって基質の供給や老廃物（反応に伴う副産物）の除去をするためのリザーバを半透膜で仕切るというやつですね。限外ろ過用のカップなんかを使って自作も出来ると書いてある本もありますが。

(無題) 削除/引用 No.1390-9 - 2009/10/23 (金) 11:18:13 - おお >[Re:8] E.coliさんは書きました : > >[Re:6] おおさんは書きました : > そうなんですよ、ほんとに参っちゃってます…。 > CBBレベルでしか発現のチェックはしていないので、本当に全く発現していないのかは分かりませんが、その程度の量なら、現在の方法ではだめってことなんでしょうね。 実際に10ngくらいあれば1つの試験ができるような場合もあり、 精製前にCBBでバンドが見つからなくても、何とかなるケースもあります。 活性を持ったものと考えると、マイルドなかよう化になるので まあ封入たいに行ってしまうことが多いですけどね。 > 結局、いろいろ試してみるしかないんでしょうね。 確かに、、、でもほんとに全くといって発現が認められないなら、 ちょっとその系とかプラスミドはあやしいなぁと思って、ちょっと 違う系にしようとは私なら思うかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.1390-8 - 2009/10/23 (金) 10:13:52 - E.coli >[Re:6] おおさんは書きました : > 全く発現は見れませんかね、、、ちょっと不思議です。 > レアコドンを含んでいるのが原因であることもあるようで、 > レアコドンに対するtRNAの補給で解決した例も見たことが > あります。 そうなんですよ、ほんとに参っちゃってます…。 CBBレベルでしか発現のチェックはしていないので、本当に全く発現していないのかは分かりませんが、その程度の量なら、現在の方法ではだめってことなんでしょうね。 レアコドンに関しては、そういうこともあろうかと、今回は一応それらを全て排除したコンストラクトを作成しています。 結局、いろいろ試してみるしかないんでしょうね。

(無題) 削除/引用 No.1390-7 - 2009/10/23 (金) 01:21:21 - A これも「やってみないと分からない」レベルの話ですが今発現しようと している蛋白質が全長で機能ドメインが分かっているのならそのドメイン のみもしくは全長よりも短いコンストラクトを作ってみるのも手か もしれません。何も理論的な裏づけは無いのですがほとんど同じ蛋白質 であっても2-3アミノ酸のある無しで発現からその後の蛋白質の挙動まで 劇的に変わった例を見たことがあります（この時は機能ドメインでした）。 以前のラボの同僚がその幸運な方で彼のライバルラボは不運なコンスト ラクトを持っていたそうです。学会でいろいろ話して分かったそうで 幸い同僚が先に論文にできました。まあコンストラクトから作り直すので あれば別の発現系に代えるほうが手っ取り早いかもしれませんが。

(無題) 削除/引用 No.1390-6 - 2009/10/23 (金) 00:56:18 - おお >[Re:5] E.coliさんは書きました : > 低温培養による発現誘導も簡単にできるので結局はやってみるのですが、もし可能性があるのなら、どういう理屈がそこ成り立つのか、ちょっと興味がありました。やはり、フォールディングの問題が大きいのでしょうかね。ケースバイケースってこともあるし、難しいですね。 理屈はあってないようなものですが、低温の培養は、 プロテアーゼ活性を抑えられるともいわれていて、 分解抑制も一つの要因です。 また、よくかよう画分にきやすいといわれていますが、 これはタンパクの合成速度が遅くなるためタンパク同士 のアクシデンタルなアグリゲーションをおさえるからだろう という考え方があります。 全く発現は見れませんかね、、、ちょっと不思議です。 レアコドンを含んでいるのが原因であることもあるようで、 レアコドンに対するtRNAの補給で解決した例も見たことが あります。 毒性であればたしかにｉｎ vitroのほうがいいでしょうね。

(無題) 削除/引用 No.1390-5 - 2009/10/22 (木) 20:08:33 - E.coli 皆様、ご意見、情報ありがとうございます。 確かに、こういう時はシステムをさっさと変えてしまったほうが、断然早かったりしますよね。in vitroの系は使ったこと無いのですが、興味あります。発現量が十分なら是非使ってみたいですね。 低温培養による発現誘導も簡単にできるので結局はやってみるのですが、もし可能性があるのなら、どういう理屈がそこ成り立つのか、ちょっと興味がありました。やはり、フォールディングの問題が大きいのでしょうかね。ケースバイケースってこともあるし、難しいですね。

(無題) 削除/引用 No.1390-4 - 2009/10/22 (木) 18:18:42 - AP 発現が見られない、大腸菌が死んでるみたい、で毒性が疑われるとき、最近では良いin vitro発現系（in vitro transcription/translation）がありますので、私はそちらに逃げます。 私自身は使ったことないですが、BL21(DE3)からセレクションをかけて得られた、発現タンパク質の毒性に耐性をもつ宿主というものも市販されています。どんな毒性タンパク質にも有効というわけではないでしょうが、原著では確か膜タンパク質の発現による毒性に耐性で、封入体に発現タンパク質を得られたという話だったと思います。 ttp://www.cosmobio.co.jp/product/raku/01220008.asp

(無題) 削除/引用 No.1390-3 - 2009/10/22 (木) 16:13:53 - m 経験があると言っても 全く同じタンパク質を扱っている場合でないとあまり参考にならないと思いますが・・・。 なので、 ＞このような場合、低温培養下での誘導によって、発現が見られるようになることってあり得るのでしょうか？ あるかもしれないし、ないかもしれない。 やってみるしかない。 これが結局の答えになるかと思います。

(無題) 削除/引用 No.1390-2 - 2009/10/22 (木) 14:57:00 - Eco 大文字で書くくらい超toxicなら、誘導掛ける前から見て分かるくらい生育が悪くなるでしょうね。 フォールディングが悪いと必ず封入体になるという訳ではなくて、分解されてしまう場合もあるので、低温培養でフォールディングが改善すれば収量が増える可能性はあると思います。

大腸菌による組換えタンパク質発現 削除/引用 No.1390-1 - 2009/10/22 (木) 14:49:35 - E.coli 大腸菌(BL21;DE3)にて、ある組換えタンパク質を得ようとしておりますが、TOXICなせいか、全く発現してくれません（封入体でも欲しいぐらいなのですが、それすらない…）。 このような場合、低温培養下での誘導によって、発現が見られるようになることってあり得るのでしょうか？目的タンパク質が可溶化しやすくなるってことはよく経験したことあるのですが…。 どなたかご経験あるかた教えていただければ幸いです。

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