全12件 ( 1 〜 12 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.1383-12 - 2009/10/26 (月) 11:43:35 - T・T >>おお様 仰います通りで、これから遠沈菅の中で攪拌しようという意見（ロスを減らす）がありましたのでそちらで検討しようと考えていました。 有難うございます。 >>C様 濃度は、あくまで大方一緒としか言えませんね。 今までの差でいいますと、大体0.05mg/mlくらいの差はあります。 また、×ｇ（大スケールですとMAXで14530×gですが）と遠心時間に関しても今後検討していきたいと考えています。

(無題) 削除/引用 No.1383-11 - 2009/10/26 (月) 11:37:23 - T・T >>Ａ様 溶液の粘度については、考えていませんでしたね。 ナイロンネットについては、今後検討していきたいと考えています。 貴重なご意見ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.1383-10 - 2009/10/22 (木) 12:44:29 - c スモールスケールとラージスケールでは蛋白質濃度は同じくらいですか？　蛋白質濃度が低いと沈殿形成に時間がかかり、場合によってはうまく沈殿しないことがあります。 また、xgを変えてみたり、遠心の時間を延長してみたらどうでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.1383-9 - 2009/10/22 (木) 05:40:11 - おお 50mlの遠ちん管に直接サンプルをいれて、 そこに硫安を追加して、ローテーターとかで 溶かしてはどうでしょうか。 もうちょっと遠心力欲しいようなきがしますが、、、、 あと、スモールスケールより若干硫安を濃くしたり すると回収量は改善されるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.1383-8 - 2009/10/22 (木) 00:40:19 - A >飽和硫安溶液の場合、希釈されてしまいますし飽和度70%が目的でsolution >が大量ですと濃い飽和硫安溶液(90%近く)を作製できたとしても難しいかも >しれませんね。 遠心による回収を行う場合は溶液の粘度の問題もあって70%ぐらいが限界 だった様に思います。 私自身はやったことありませんが「蛋白質・酵素の基礎実験法　 堀尾武一（南江堂）」によると濾過やナイロンネットを用いて沈殿を 集める方法もあるようです。大量の溶液になった場合はこちらの方が 効率的かもしれませんね。回収率がどうなるのか定かではありませんが。

(無題) 削除/引用 No.1383-7 - 2009/10/21 (水) 20:33:31 - ルンバ > 考察としては、遠沈菅の表面積が大きいことから まさか、ネズミとゾウの話知らないの？

(無題) 削除/引用 No.1383-6 - 2009/10/21 (水) 15:00:15 - T・T >>774様 固形硫安と飽和硫安溶液についてなのですが・・ 飽和硫安溶液の場合、希釈されてしまいますし飽和度70%が目的でsolutionが大量ですと濃い飽和硫安溶液(90%近く)を作製できたとしても難しいかもしれませんね。 bufferを飽和硫安溶液へ置き換えられたら良いのですが。。

(無題) 削除/引用 No.1383-5 - 2009/10/21 (水) 14:40:46 - T・T >>774様 すみません。記載するのを忘れていました・・・。 もう一つ行った方法がありまして ４℃で一晩静置するのではなく４℃でスターラーで攪拌しながら一晩置いた結果もあるのですが、やはり40%強くらいの回収率でした。 よって、攪拌が足りなかったことはないかと思います。 ただ、ビーカー内にタンパク質が塩析したような固形のものがありました。こちらについてはbufferで何度もピペッティングで落としたので問題ないかと思います。

(無題) 削除/引用 No.1383-4 - 2009/10/21 (水) 14:31:23 - 774 > 小スケール > 1.5mlチューブに1.0Mリン酸NaBuffer(pH7.6)+0.3M NaCl存在化のsolutionを入れて液量に応じた硫酸アンモニウムを加えた後ゆるやかに指で攪拌しながら溶かす。 とありますが、撹拌が不十分ってことはないですよね？ 学生のころ、塩析を行なう際に「スターラーで撹拌しながら硫安を少しずつ加えて、確実に溶解させるように」と教授から指導を受けたので、指で撹拌って十分なのかな？と思っちゃいました。 希釈かかっちゃいますけど、固形硫安ではなく飽和硫安溶液を加えるのはいかがですか？

(無題) 削除/引用 No.1383-3 - 2009/10/21 (水) 14:30:30 - T・T >>植物屋様 勿論、1.0Mリン酸NaBuffer(pH7.6)+0.3M NaClに70%飽和度（小スケールにて一番回収率が多かった飽和度。再現性あり）にあるように硫酸アンモニウムを加えたbufferを用いていますよ。 確かに小スケールの時と同じ回収率を望むのは難しい話かもしれませんね。 小分けしてもいいのですが・・solutionが大量にあり少量ずつやっていけるほどの時間もないので大容量（500ml遠沈菅）で行う予定となっています。 その中でいかに効率よく回収できるか知りたくこのトピックを立たせていただきました。誠に身勝手かとは思いますが、何か改善策がありましたら宜しくお願い致します。

(無題) 削除/引用 No.1383-2 - 2009/10/21 (水) 14:11:33 - 植物屋 当然ながら、ビーカーを洗浄する際は硫安入りのバッファでやってますよね？ 回収率はスケール変わると変わってくるものと経験から思ってます。 遠心のｇは、チューブの底の値だと理解してますので（間違ってたらご指摘ください）、 ５０mLのチューブの上層にかかってるｇが足りなくて 落ちてこないのでしょうか。。。 だとすれば、gを上げるか、一本当たりの液量を少なくして回せばなんとかなるかもしれません。 スケールを上げた際にバッファ中にあるタンパク濃度が低ければ落ちにくくもなりますし、 ほどほどの回収率の上昇を目指す（が、小スケールと同等まではたぶん無理）というところが妥協点だと思います。

硫安沈殿について 削除/引用 No.1383-1 - 2009/10/21 (水) 13:52:49 - T・T 今現在、約100kDaの分子量を持つタンパク質を精製し硫安沈殿により濃縮を検討しているのですが、一般的な方法で行った際小スケールだと70%近く回収できるのですが大スケールで行うと40%くらいしか回収できず困っています。 小スケール 1.5mlチューブに1.0Mリン酸NaBuffer(pH7.6)+0.3M NaCl存在化のsolutionを入れて液量に応じた硫酸アンモニウムを加えた後ゆるやかに指で攪拌しながら溶かす。 完全に溶けたことを確認して一晩4℃で静置させる。 翌日10.000×gで遠心してタンパク質をppt状にした後に上清を捨ててpptに1×PBSで懸濁する。 大スケール ビーカーに1.0Mリン酸NaBuffer(pH7.6)+0.3M NaCl存在化のsolutionを入れて液量に応じた硫酸アンモニウムを少量ずつ加えながらスターラーで攪拌し溶かす。 完全に溶けたことを確認してそのまま4℃で攪拌し続ける。 翌日ビーカーから50ml遠沈菅に移してビーカーにも蛋白が付着している恐れがあるのでbufferで共洗いする。 10.000×gで遠心してタンパク質をppt状にした後に上清を捨ててpptに1×PBSで懸濁する。 考察としては、遠沈菅の表面積が大きいことから遠心して上清を捨てて懸濁する際に遠沈菅内に付着してしまっていたことが考えられるのですが他にもこのプロトコルに問題がある場合は、ご意見を頂戴したく思います。

全12件 ( 1 〜 12 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

---