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(無題) 削除/引用 No.1380-10 - 2009/10/22 (木) 10:40:00 - ゆう う　さま はい。もちろん、細胞内の小胞は エンドサイトーシスだけでないことは承知しています。 「固定細胞では絶対エンドサイトーシスが起こらない」 は、私も内心そう思っています。 私の前提は、「細胞を固定後、細胞膜を透過処理しなければ、 抗体やゴールドは細胞内に入らない」でした。 だから、細胞内小胞膜に局在しているゴールドを見た時は、 目が点になったのです。 うさまの答えが、私の知りたかった事かと思います。 「固定した後、細胞膜を透過処理をしなくても、 抗体やゴールドは細胞内に入ることがある」 という認識を新たに持ちたいと思います。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.1380-9 - 2009/10/22 (木) 09:50:06 - う （間違って送信しました、続き） いくら膜を積極的に処理しなくても 多少は染まることがあることを 私は経験しています。 程度の問題ですが。

(無題) 削除/引用 No.1380-8 - 2009/10/22 (木) 09:47:45 - う あと、基本的なことなのであえて書きませんでしたが、 細胞膜に存在するタンパク質というのはもちろん ER→ゴルジ体→細胞膜 と輸送されてくるものですので 何も細胞膜→エンドサイトーシスとか ばかりではないです。

(無題) 削除/引用 No.1380-7 - 2009/10/22 (木) 08:44:29 - ゆう CJさま 私はまだ定量はおこなっていません。 実際に定量する時に参考にさせていただきます。 ありがとうございました。 でも、今回は、金粒子が細胞内にぱらぱらあるのではなく、 細胞内小胞膜に局在しているので、 やはり単なるバックグラウンドではない と思っています。

(無題) 削除/引用 No.1380-6 - 2009/10/22 (木) 08:41:09 - う 単純に、染色されているかどうかネガコンポジコンをおいて実験をする 基本的なことをする。 蒸すかしく考えることではないと思います。 まずはそれからでは？

(無題) 削除/引用 No.1380-5 - 2009/10/22 (木) 08:36:36 - CJ 金粒子は定量性があるので、数を数える人が多いですが（私はやったことないです）、その際に「確実にその物質が存在しない場所」の金粒子密度を計測しておけば、観察された金粒子がシグナルなのか、ノイズなのか判定できますね。

ありがとうございます 削除/引用 No.1380-4 - 2009/10/21 (水) 12:28:14 - ゆう CJさま、　うさま ゴールド粒子を見る場合のバックグラウンド補正というのは、 例えば、どのような事をするのでしょうか？ 初心者なもので、すみませんが、教えていただけると助かります。 細胞内にあるゴールド粒子は、 細胞内にある小胞の膜上に局在しているので、 固定後、インターナリゼーションがおきているように見えました。 でも、そうではないという線で考えた方が良いのですね。 例えば、パラホルムアルデヒドを行うと、 膜に損傷がおきて、そこから抗体等が細胞内に入り、 細胞内の小胞膜にあるタンパク質の細胞質側に 抗体等が非特異的に結合してしまった。 （あるいはパラホルムアルデヒドが小胞膜も損傷し、 抗体等が小胞内に入り、固定前にインターナリゼーション されたいた目的タンパク質を認識した） というような事でしょうか？ このぐらいしか思いつきませんでした。 もっと他に考えるべき事がありましたら、 具体的なアドバイスを宜しくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.1380-3 - 2009/10/20 (火) 21:52:49 - う ＞パラホルムアルデヒドで固定した後でも、インターナリゼーションがおこったりするものでしょうか？ そんなことありません。 その可能性を考えるよりも、他に考えることのほうが多いと思います。

(無題) 削除/引用 No.1380-2 - 2009/10/20 (火) 19:38:43 - CJ どのようにバックグラウンド補正をかけていますか？その金粒子はバックグラウンドではないのですか？

paraformaldehyde固定ではインターナリゼーションを止められない 削除/引用 No.1380-1 - 2009/10/20 (火) 19:06:56 - ゆう 培養細胞を２％パラホルムアルデヒドで２０分固定し、膜タンパク質の細胞外を認識する抗体を使って、イムノゴールド免疫電顕を行っています。ちなみに、免疫反応後はグルタルアルデヒドや四酸化オスミウムで後固定しています。 細胞膜上でゴールドが集まっているので、実験自体はうまくいっています。でも、界面活性剤を使っていないのに、細胞内にゴールドが検出されます。まるでインターナリゼーションが起こっているかのようです。 パラホルムアルデヒドで固定した後でも、インターナリゼーションがおこったりするものでしょうか？

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