全5件 ( 1 〜 5 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.1363-5 - 2009/10/19 (月) 18:44:56 - orz ＞PCRの段階では確かに目的の1500bpの産物が得られますし、 ちょっと待ってください、それはシーケンスまでチェックしましたか？ もしかしたらノンスペかもしれません

(無題) 削除/引用 No.1363-4 - 2009/10/19 (月) 18:39:34 - orz 何回やったのかわかりませんが、抗生物質がきつすぎませんか？ そして、回復培養の時間が長すぎませんか？ 二点が揃ったとき、ベクター内の配列が抗生物質をコードする領域のあたりを残してちぎれていたことがありました。 抗生物質の濃度を落として、回復培養を短めにしてみてはどうですか？ ひょっとすると、コロニーもほとんど同じクローンを拾っているのかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.1363-3 - 2009/10/17 (土) 05:44:41 - おお まず、PCRの条件をできるだけ厳しくしてみるのは やってみる価値があると思います。というのは メインにみえるバンドが1本でサイズが正しとしても 検出できないバックグランドでへんなDNAがうようよ しているかもしれません(可能性は少ないと思いますが やっとけば安心というていどで)。 あとインサートは入っているので、やはりなにか が原因で削れやすいかもしれません。大腸菌をかえる のは確かに一つの選択肢ですね。XL1-Blue MRF' とか hsdR17(rK- mK+)のジェノタイプのもととかが ベターな結果が得られる可能性があります。 トランスフォーメーションの時のDNAを極力へらすのも いいかもしれませんね。これはなるべく菌に複数の プラスミドが導入されないようにするためです。 せっかく当たりが大腸菌にはいっても同時にもっと増えやすい プラスミドが共存すると淘汰されてしまいます。 あとは大腸菌内のプラスミドのコピー数を抑制するために 30度クラいの低温とか、こうせい物質の濃度をさげる とか、インサートが毒性を示す可能性がある時に は効果があるようです。 ケミカルコンピテントならヒートっショックを37度でやる。 っていうのもここで聞いたことがあります。不安定な プラスミドの場合は有効だと聞いています。 同時にプラスミドを変えるなど違うストラテジーも 考えてみてください。理論的に何ら問題がないように みえても、うまく行かないというのにたまに打ち当たります ので、複数の手を用意するのは悪くないとおもえます。

(無題) 削除/引用 No.1363-2 - 2009/10/17 (土) 00:01:34 - ~ 繰り返し配列などがあって、デリーションしたのでは？

ベクターに挿入するとインサートが削れる？ 削除/引用 No.1363-1 - 2009/10/16 (金) 21:52:46 - これしん シロイヌナズナのある遺伝子のORF全長を、RNAを逆転写して得られたcDNAを鋳型としてPCRで増幅し、これをTAクローニングするということを行っています。もともとベクターに入りづらいようで、これまでに拾えたインサートも数は少ないのですが、おかしなことに、どれも中間の配列が欠落していたものでした。全く同じ場所が欠落するわけではありませんが、大体同じような場所です。PCR産物は約1500bpなんですが、インサートは600bp程抜け落ちていました。 PCRの段階では確かに目的の1500bpの産物が得られますし、勿論ゲルからの精製も行うので、原因が分かりませんでした。まずはRNAからとりなおしてみたり、ベクターや菌株を変えて試してみたりもしましたが、やはり同じ現象が起こってしまいます。 どうやったらうまくいくのか、などの改善案は今度ボスとディスカッションする予定なんですが。まず、こういう現象が起こりえるものなのか？ということが知りたいです。大腸菌がこの断片を嫌ってるんでしょうか。

全5件 ( 1 〜 5 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

---