全16件 ( 1 〜 16 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

本当にありがとうございます。 削除/引用 No.1359-17 - 2009/10/19 (月) 13:24:36 - pathol みなさま、本当にありがとうございます。 ゲル内消化や、液から直に解析など、方法をよく考え、実験してみようと思います。 ＭＳをやっている人が近くにいないため、本当に勉強になりました。 ありがとうございます。 今後とも、ぜひ、このサイトでいろいろとご教授いただけますよう、お願い申しあげます。

(無題) 削除/引用 No.1359-16 - 2009/10/19 (月) 02:36:15 - c もしもクマシーゲルからやるならば、染まっているバンドだけ切り出すと、この時点で自分でセレクションかけてしまい、かなり量の多い蛋白質だけしか見られなくなるので、レーンを上から順に適当な大きさに小さく切って、バンドありなしに関係なくレーン全ての分子量領域を見た方がいいです。直接間接含めてインターラクションする蛋白質は通常、非常に多いとおもいますし、もともとの存在量が多いものは、結果としてあまり重要でなくても共沈物のなかではメジャーな蛋白質として見えてくることがあるので。 それでこうした手間をかけないという点で免疫沈降物を直接トリプシン消化するのも得策かなとおもいます。分析するほうもそのほうが楽でしょうし。 いずれにせよそのあとで、個々の蛋白質について抗A抗体でIP-同定された蛋白質の抗体でWB（できればその逆のパタンも）して確認した方がいいです（全部はむりでもすくなくとも機能的に興味あるものは）。

(無題) 削除/引用 No.1359-15 - 2009/10/18 (日) 19:26:31 - Ｍ 実際的な話として、ケラチンのコンタミが少なくなるような条件で 処理し、更に確実性の高いMSデータがとれるようにすることが 大事かと思います。 ゲルから処理した方が好ましいのでは？

(無題) 削除/引用 No.1359-14 - 2009/10/18 (日) 16:47:29 - USB pathol様 　皆様がご指摘されてますように、泳動しなくても質量分析にかけることが可能なようですね。私の不勉強で混乱させてしまい申し訳ございません。 　また、やはり皆様がご指摘されておられますが、最終的には委託先の方とよくご相談される方がよろしいかと思われます。 　ただ、私の場合は一つ一つ切り出してゲル内消化後、抽出したものを委託先に提出しておりました。ですので免沈後のものを直接質量分析にかけるというのは、あたりが見つけにくそうだなという印象を持ちます。 （あくまで私見です） いいものが釣れてくるとよいですね。 頑張ってください

(無題) 削除/引用 No.1359-13 - 2009/10/18 (日) 13:07:32 - 千夏 patholさんの要望に応え、かつここで懸念されている事項をクリアした方法が10月に行われた学会で発表されています（先方にご迷惑をおかけすることになるかもしれませんので、詳細についての記述は避けさせていただきます）。調べてみてコンタクトをとってみてはいかがでしょうか？？

(無題) 削除/引用 No.1359-12 - 2009/10/18 (日) 02:27:15 - おお 免疫沈降後直接マスに持っていきたいのなら、 沈降したレジンをトリプシン処理してLC-LC-MSという流れも くめます。 また、SDSサンプルバッファーに溶解して、SDSPAGEの下のゲルに 入ってから6mmほど流して、タンパクがあるフラクションを総たんぱく質 として、ｉｎ gelで消化するてもあります。 ただしIgGやprotein A/Gなど可也交じってくる とおもいます。同時にこのようにするとバックグランドも 可也拾いますので、ネガティブコントロールを慎重に 取らないといけませんし、それでも場合によって100程 のタンパクが同定されて、どこまでが本当かとか解析で じっくりとした考察、検証が必要になってくると思います。 あとはレジンからの溶出をくふうしてIgGなどのコンタミを 極力避ける方法がよく取られるのではないかとおもいます。 TAPタグで網羅的なコンプレックス解析をしたというプロジェクト もありますし、そういうのを参考にされると言いかと 思います。

(無題) 削除/引用 No.1359-11 - 2009/10/18 (日) 02:24:05 - K MS屋です。 免疫沈降するサンプルの複雑さによります。 SDSはHPLCカラムにも質量分析装置にも悪影響を及ぼすのでそのまま注入することはしませんし、ある濃度を越えるとトリプシン消化にも影響を及ぼす（ミスclevage）のでバッファー交換をする必要があります。 何が一般的かではなく、実験の目的、どういった結果を期待しているか、 抽出液に含まれると予想されるものは何か、などを考えて、委託先と相談なさるといいと思います。

(無題) 削除/引用 No.1359-10 - 2009/10/18 (日) 02:14:33 - c ゲル電気泳動してバンド切り出す方法も、電気泳動せずに溶出物を直接酵素消化してマスにかける方法もどちらもおこなわれています。それぞれ一長一短がありますので、研究目的やサンプルの事情等によりどちらにするか決めれば良いと思います。これからの時期は大きな学会がありますからそうした機会に、蛋白質のLC-MS/MSの専門の方に相談するとよいでしょう。

(無題) 削除/引用 No.1359-9 - 2009/10/18 (日) 01:48:49 - ルンバ RapiGestに一票

(無題) 削除/引用 No.1359-8 - 2009/10/17 (土) 17:45:50 - pathol ＵＳＢさま ご指摘ありがとうございます。一応、クマシーではバンドは複数きわめて薄いですが確認されています。 LC-MS/MSは完全素人なので、教えていただきたいのですが、私は、ゲル内消化して目的バンドも同定できると思いますが、抽出溶液の一括解析ができると理解してお聞きしておりました。解析時には、やはりバンドをゲルから切り出して、そのバンドを一つ一つ解析に依頼するのが一般的なのでしょうか？あまりにも基本的な質問で申し訳ありません。 ご教授いただけましたら幸いです。

(無題) 削除/引用 No.1359-7 - 2009/10/17 (土) 17:34:56 - USB 少し気になりましたのでコメントさせていただきます。 　Aと相互作用するタンパク質を免沈→LC-MS/MSで同定したいということですが、免沈したものをSDS-PAGEで泳動しCBB染色や銀染後、相互作用するタンパク質がバンドとして見えることを確認されているのでしょうか？ 　もしご存知のことを申し上げていれば申し訳ありません。 私の理解ですとLC-MS/MSで相互作用するタンパク質を同定する場合 免沈→SDS-PAGE→目的のバンドの切り出し→ゲル内消化→抽出→LC-MS/MS という流れになります。 仮に免沈以降を委託するにしてもどのバンドを同定するかについては前もって決めておく必要があると思います。 　委託先とよくご相談されるのがよろしいかと思います。

(無題) 削除/引用 No.1359-5 - 2009/10/17 (土) 05:51:15 - おお マスをどのようにするか、考えてからですね。 もし他の人に依頼するなら、そちらに相談した方が いいと思います。 SDSサンプルバッファーで溶出してそのまま直接はマスにかけれないでしょうし、 普通かけないです。

(無題) 削除/引用 No.1359-4 - 2009/10/17 (土) 05:10:04 - Tb よくわからないのですが、溶出後、SDS-PAGEをかけないのでしょうか？共沈殿したといっても、まだ混ざりものだらけだと思うのですが？

(無題) 削除/引用 No.1359-3 - 2009/10/17 (土) 03:32:29 - c SDSだとそのあとのトリプシン消化やMSの分析で支障が出る可能性があると思うので、代わりに、出来るだけ少量の8Mくらいの尿素で溶出してから酵素反応出来るくらいまで希釈してトリプシン消化に持っていくのが無難ではないかなと思います(並行して行っているであろうコントロールのIPも同様）。この辺りの具体的なやり方はプロテオミクスの学生向けの実験書などに詳しく出てると思うのでそれを見でもらえればと思います。 補足ですが、この手の実験で相手にする蛋白質は微量である場合が多いと思うので、ちょっとしたロスやコンタミもかなり痛いですから、透析とかMSに行く途中の操作はできるだけしなくて済むように実験を組んだほうがいいと思います。

(無題) 削除/引用 No.1359-2 - 2009/10/16 (金) 22:59:51 - K 対象にしているのは蛋白質ですか？低分子ですか？ 蛋白質でしたら酵素消化してペプチド断片化しないと同定は難しいです。 SDSを含むサンプルバッファーそのままでは私は質量分析装置に導入しません。HPLCにも入れません。脱塩やバッファー交換してから導入します。 対象とするものが不明瞭なので詳しくお答えできませんが、一度関連する論文を読んでみてはいかがでしょうか。Ｍ＆Ｍの項には詳細が書かれています。

免疫沈降物から質量解析 削除/引用 No.1359-1 - 2009/10/16 (金) 15:43:08 - pathol はじめまして。 ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる質量解析についてご教授ください。 現在、ある分子（Ａ）と相互作用する分子を検索しております。 共免疫沈降法により、Ａが再現よく落ちてくるところまで実験は終わっております。今後、共免疫沈降溶出物をＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより解析し、Ａと相互作用している分子の候補を解析していきたいと考えておりますが、免疫沈降物の溶出バッファーはSDS sample bufferでＬＣ−ＭＳ／ＭＳは解析可能でしょうか？溶出液自体を解析したいと考えております。 初歩的な質問で大変恐縮ですが、ご教授いただければ幸いです。 どうぞ、よろしくお願いいたします。

全16件 ( 1 〜 16 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

---