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(無題) 削除/引用 No.1352-19 - 2009/10/16 (金) 19:51:35 - CJ 以下は単なるコメントです。 ドット状ってのはalexaがへばってると良く起こるんですよね。 alexaはいい色素ですが、よくまったく染まらないのを売りつけられることがあります。交換すると良くなったりするので、品質管理に問題があるのでしょうか。私は購入直後に2次抗体のチェックをしています。 あと、保存性にも難があるようで、分注して−80度で保存することにしています。

(無題) 削除/引用 No.1352-18 - 2009/10/16 (金) 15:17:40 - るみのん ねうろんさん 抗フラッグ抗体の情報をありがとうございます。 まずは二次抗体と一次抗体の希釈率と固定を振ってみます。

(無題) 削除/引用 No.1352-17 - 2009/10/16 (金) 15:04:28 - るみのん なんだかいろいろな方に親身に相談に乗ってもらい嬉しいです。 買い替えは、確かに賛否両論だとは思いますが、 買い替えでもだめなら二次抗体がへたっているせいで うまくいっていないというのは論理的には甘いですが、 現実的には判断指定いいかなと思います。うまくいけば、それをつかえばいいですし。 学生の身分ですが、幸い自己裁量のお金が数十万ありますのでまぁ買い替えでも いいかなと。 使えない抗体がやまほど売っているのはもちろん知っています。 Alexa555は、それほど評判が悪いですか？全てを疑えという姿勢は 正しいかもしれませんが、抗体を買うのにそれほど抵抗があるか、ないかと いうことも判断に影響しているのかなぁと思ったりします。

(無題) 削除/引用 No.1352-16 - 2009/10/16 (金) 14:51:16 - ねうろん 連続で恐縮です。 私は二次抗体買い替え派？の一人ですが私も何もいきなり買い替えろと言ってはいませんよ。質問者様の提示した情報から私は二次抗体が怪しいかなと思っているだけで。私が思いつく、それを調べる手段は提示しました。 ただいきなり買い替える、ってのもお金の問題がないならありじゃないですか？ それで昔の二次抗体と比べて違いがあるかないか、あれば原因は二次抗体。なければ他。と進捗はするでしょうし。 かつ使える二次抗体だったならばそのままキープすればいいし。 こう書くと二次抗体販売会社の回し者みたいですが、先述した通り、私ならまず他をあたりますよ、と。

(無題) 削除/引用 No.1352-15 - 2009/10/16 (金) 14:36:44 - ねうろん >>るみのん様 すいません、すっかり忘れてました。 "rabbit anti-FLAG polyclonal (sigma)"ってF7425ってやつですか？ だとすれば、目的の融合タンパク質を少し前に染めました。今手元に資料がないので希釈率やlot No.が定かではありませんが、ドット状の染色ではなく、過去に報告がある通りの染色像でした。 染色条件はおおまか質問者様が示した通りです。細胞種、blocking bufferの組成は異なりますが。 とするとやっぱり二次抗体が…

(無題) 削除/引用 No.1352-14 - 2009/10/16 (金) 14:18:16 - 。 二次抗体が悪くなっていないとしたら買い直しただけお金と時間の無駄だった、ってなると思うのは私だけ？

(無題) 削除/引用 No.1352-13 - 2009/10/16 (金) 14:10:35 - う 熱くなる？ ＞時は金なりな状況ですので、二次抗体を買い替えする予定に しています。同じ商品の買い替えですが。 別にどうでもいいですが、売ってある抗体でも使えない抗体は存在する ということはある程度実験をしている人であるのならばよくあることとわかるかと。 それで、問題が「使える抗体か？」ってのを念頭に置くことがまずは重要かと思っただけです。 まぁ、私にはそれをしないで、２次抗体を買い替えることが 時は金なり、ということになるとは思いません、個人的に。 楽して実験結果を出すということと、手を抜くということは同じことではないと 言ってもしょうがありません、ね。

(無題) 削除/引用 No.1352-12 - 2009/10/16 (金) 13:32:03 - るみのん 確かに抗体染色の比較は考えました。もっとも正攻法なやり方だと 思います。しかし、時は金なりな状況ですので、二次抗体を買い替えする予定に しています。同じ商品の買い替えですが。 ガンマは、中心体のマーカーです。が、どうも 細胞によって同じ抗体でも染まり方が違うようです。 きれいに染まるものもあれば、結構ぎりぎりな感じで そまる細胞もあるようです。論文的には。 そういう意味で、いまあつかっている細胞では モノクロ時の染色像がいまいちな感じでも しょうがないのかなぁと。きれいに見えている細胞が 手もとにあれば当然それをつかって条件をきめたいところです。 いろいろな考えをいただき、ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.1352-11 - 2009/10/16 (金) 13:13:17 - ねうろん >>うさん なんだか熱くなられているようですが、冷静に。 質問者様はこのトピックで二つの質問をしてますよね。 一つ目はgamma-tubulinの染まりが今ひとつ。改善点は？ 二つ目はポリクロを使った時、flagもtubulinもドット状の異常な染色像（但し一次抗体無しでは異常なし）。改善点は？ 一つ目に関して、gamma-tubulinは扱った事有りませんが、一般的に（細胞骨格の）染色の際、固定剤や温度（固定またはもし固定前にwashしているのであればそのBufferも））を気にしますよね。ただし少なくともbeta-tubulinの染色に関して言えば4%PFAで問題なく綺麗に染まっているのですが、、、抗体、細胞によりけりなんですかね？ 二つ目に関して、それでもなお私も二次抗体を疑います。コントロールとして一次抗体なしではなく、control IgGや他のポリクロ抗体を置けませんか？それでもなおドットの染色が観察されるのであれば、、、まぁ買い替えましょう。遠心（15000g, 30min位）で二次抗体中のdebrisを除くという方法も有りますが、まぁそうそう改善しませんし、抗体そのものがへたっているのであれば意味がない操作です。 ただし「う」さんが仰っているようにまずシンプルに一つずつ染めて問題を解決した方がいいと思いますよ。抗体勿体ないですし（すいません、ケチ臭くて）。

(無題) 削除/引用 No.1352-10 - 2009/10/16 (金) 12:27:09 - 。 ＞ちなみに二回目のガンマチューブリンもいまいっぽでした。 いまいっぽってどういうこと？

(無題) 削除/引用 No.1352-9 - 2009/10/16 (金) 12:10:07 - う 固定法とか、抗体濃度（これはいいとしても）とかをいじることこそ パラメーターを増やしている気がするのですが。 要するに、 モノクロではチューブリンはきちんと染色されるのでしょう？ モノクロではフラグもきちんと染色されるのでしょう？ 固定がどうとか言う話をもってくるとパラメーターが増えるだけでは？ では、 チューブリンをモノクロとポリクロでそれぞれ別に染めた時どうなるのか？ フラグをモノクロとポリクロでそれぞれ別に染めた時どうなるのか？ モノクロとポリクロの染色像を比較 そして、ポリクロの時に使っている２次抗体を、他のタンパク質に対する１次抗体で使った時は うまくいくのか、いかないのか。２次抗体が使えるというポジコンを用意する。 これらの結果を総合すると、そもそも１次抗体が使えないものかもしれない、とか、 （処理されていると思うが）他の一次抗体に２次抗体が反応しているかも、とか、 わかるってものではないでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1352-8 - 2009/10/16 (金) 10:17:05 - るみのん あかねさん 固定と透過を同時に行うプロトコルがあるんですね。知りませんでした。 勉強になります。 うさん 確かにそのとおりですが、変数がいまいちわからないので、 まずはできるところから変えていこうと思います。 未熟者ですので、いろいろおおしえください。

(無題) 削除/引用 No.1352-7 - 2009/10/16 (金) 10:14:02 - う ポリクロで染めた時、 チューブリンをポリクロで染めた時、 フラグをポリクロで染めた時、 要するにポリクロで染めたときは、チューブリンだろうがフラグだろうが 細胞全体が鮮やかにドットがたくさんみえるのでしょう？ 私は読解力がないので、そう読んでしまいましたが。 それならば、固定がどうとか言う問題ではないのでは？

(無題) 削除/引用 No.1352-6 - 2009/10/15 (木) 19:37:23 - あかね 骨格系の染色は固定方法がすごく大事です。 以下の論文読んでみてください。 骨格系の染色の固定方法をいくつか検討しています。 ちなみに、GAを固定に用いる際に、Backgroundが発生するのですが、それを抑えるのにNaBH4はすごく有効でした。その点も論文に書いてあると思います。 Good luck! Cell Motility and the Cytoskeleton 63:725–740 (2006) Migration of Bone Marrow Stromal Cells in 3D: 4 Color Methodology Reveals Spatially and Temporally Coordinated Events

(無題) 削除/引用 No.1352-5 - 2009/10/15 (木) 19:25:23 - るみのん 固定をメタノール-20℃,10minくらいにして、 一次抗体濃度を十倍くらい薄くしてみます。 二次抗体は、二次抗体のみでシグナルがでていないので あまり疑ってはいませんが、どんなもんでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1352-4 - 2009/10/15 (木) 18:07:54 - in situ 一次抗体もしくは二次抗体の濃度が濃すぎてドット状にノンスペが出たことがあります。 濃度の検討はしてみましたか？ あとは、二次抗体がへたってたりする可能性があります。 アグってしまっているとか。 同じ二次抗体（anti-rabbit Alexa555）を最近使っている人に話を聞いてみるとよいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.1352-3 - 2009/10/15 (木) 18:00:25 - qq tubulinのIFでformalinやパラフォルの固定がよろしくないので、グルタルアルデヒドかMeOH固定を勧めると言っておったように記憶します。 具体的なことは分かりませんのであしからず

(無題) 削除/引用 No.1352-2 - 2009/10/15 (木) 16:11:22 - う 別々に染めてみたら？

チューブリンの免疫染色 削除/引用 No.1352-1 - 2009/10/15 (木) 16:07:09 - るみのん FLAGタグをつけた遺伝子Aをトランスフェクションし、 ガンマチューブリンと共染色後、共焦点顕微鏡で観察しています。 実験条件は、 ガラスボトムディッシュにてMCF-7を培養 ４％PFA in PBS 室温15min PBSで二回洗浄 0.15% Triton/PBS　室温15min PBSで二回洗浄 3% BSA/PBS　室温30min PBSで二回洗浄 一次抗体　in 3% BSA/PBS PBSで二回洗浄 二次抗体　in 3% BSA/PBS PBSで二回洗浄 マウント です。 一次抗体には 一回目はmouse anti-FLAG M2 monoclonalとrabbit anti-gamma tubulin polyclonal (sigma) 二回目はmouse anti-gamma tubulin GTU8 monoclonalとrabbit anti-FLAG polyclonal (sigma) 二次抗体には 一回目も二回目も anti-mouse Alexa488/anti-rabbit Alexa555 観察は ex488/emBP505-530, ex543/emBP560-615で行っています。 もれなどは問題なさそうです。 一回目も二回目も、ポリクローナル抗体で染めた方が、チューブリンでも フラッグでも同じように見えています。細胞全体が鮮やかにドットがたくさんみえるのです。あきらかにガンマチューブリンの局在ではないですし、 一回目のフラッグと二回目のフラッグでも明らかに異なります。文献的には 一回目のフラッグの局在があたりっぽいです。 ちなみに二回目のガンマチューブリンもいまいっぽでした。これは細胞のせいかな・・・。 一次抗体抜きのネガコンではほとんどシグナルがでないことから、 二次抗体のノンスペシフィックの線は考えていません。 ポリクロ抗体を使うと細胞全体がぽつぽつとドットに染まるのは なぜなのでしょうか・・・。方法が決まらず、さきにすすめなくて かなり厳しい状況です。ご助言いただけませんでしょうか？

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