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(無題) 削除/引用 No.1328-6 - 2009/10/11 (日) 22:48:19 - take メーカーの情報を調べるばかりではわからないことを教えて いただいて、感謝しております。Molecular Cloningの存在も すっかり忘れていて、初心に帰らねばと思いました。

(無題) 削除/引用 No.1328-5 - 2009/10/11 (日) 15:37:28 - AP >制限酵素処理バッファーとは違うので、制限酵素処理した液を PC処理などなしでbluntingバッファー、BSA、ｄNTPを追加して反応 Klenow、T4 polymeraseどちらも、制限酵素バッファー中で50〜100%の活性がありますので、バッファー交換は不要です（Molecular Cloning参照、たぶん第2版のAppendixに詳しい）。最近は専用バッファーとかblunting bufferとか、ご親切にも添付してくれるメーカーが多いですけれど（他社との競争で、差別化するためでしょうかね）、それにとらわれると余計な手間がかかります。ちなみに、XbaIのような5'突出を埋め立ててbluntingするなら、3' exonuclease活性が低いKlenowのほうがT4より安全です（逆に3' 突出を削ってbluntingするならT4のほうが効果的）。

(無題) 削除/引用 No.1328-4 - 2009/10/11 (日) 15:13:09 - take いろいろありがとうございます。 制限酵素(XbaI)処理→blunting→CIAP処理だとライゲーションまで PC処理orゲルからの精製が２回で、 制限酵素(XbaI)処理→CIAP処理→bluntingだと１回で済むかと考え たのですが、最後に１回だけ精製されているんですね。 メーカーのHPに制限酵素処理後PC処理してbluntingとしてあるのも あったのですが、bluntingバッファーには酢酸K、酢酸Mgなど入って いて制限酵素処理バッファーとは違うので、制限酵素処理した液を PC処理などなしでbluntingバッファー、BSA、ｄNTPを追加して反応 されているんでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.1328-3 - 2009/10/11 (日) 13:46:25 - おお CIAP(脱燐酸か)を酵素処理のなかで(ライゲーションを除いて) 最後にしています。それでうまくいっているので、ずっと そのパターンです。 作業の流れ的にもすっきりするかなぁって、、、 まぁ一度パラレルにやって結果を聞かせてもらえるなら 参考になりますがそこまで期待するのも厚かましいので、、、 最近は過熱で失活しやすいAPも売ってますので、 どうなんでしょうかねぇ、、、

(無題) 削除/引用 No.1328-2 - 2009/10/11 (日) 12:45:10 - AP うーん、どうかな。 CIAP処理の後、平滑化だと、あいだにPCI抽出などの精製を入れないと、dNTPが脱リン酸されて基質濃度が減ってしまって、平滑化反応が進まなくなるばかりでなく、かえって削り込みが起こる可能性もありますね。 私がやるなら、制限酵素処理→blunting→CIAP処理で、その間には特に精製のステップをいれず酵素や基質を加えていき、最後にゲルからの切り出しまたはPCI抽出ですね。

bluntingとCIAP処理の順番 削除/引用 No.1328-1 - 2009/10/11 (日) 12:01:21 - take ベクターに平滑末端を作ってライゲーションを始めてやるので 普通どちらでやるのか知らないのですが、 制限酵素(XbaI)処理→blunting→CIAP処理は 制限酵素(XbaI)処理→CIAP処理→bluntingの順番でも可能でしょうか。 （反応図を見て考えるとどちらでもよいと思ったのですが。）

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