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(無題) 削除/引用 No.1327-6 - 2009/10/11 (日) 15:04:04 - Q >[Re:1] APさんは書きました : > この場合は、B-Cとの相互作用がB抗体ではマスクされてしまうのかとも思うのですが、 B-C結合は抗体をライセートに添加する前に既に行われているので、これはむしろ抗B抗体の認識エピトープがB-C結合によって阻害されていると考える方が良いように思います。 ご提示のデータではA-Bのco-IP、A-Cのco-IPは検出できるけどB-CあるいはA/B-Cのco-IPが見れないと言うことですね。 素直に考えればA-B複合体とA-C複合体が存在するけどB-CあるいはA-B-C複合体は存在しないか非常に少ないという結果になると思います。 もう少し詳しく確認する為にはCでIPしてA,Bのco-IPを見るのが良さそうに思います。あるいはAでIP、B,Cのco-IPをみる、でしょうか。 これまでA-B,B-Cの複合体が別々に証明されていて、故にA/B/Cが存在するという話で済まされていたが、実際はA/B,B/Cが別々に存在していてA/B/Cは殆ど存在していないことが明らかになるという例は見受けます。これはA/B/Cのシグナル伝達が行われていないということではなくて、タイムコースによってシーケンシャルに複合形成が行われているという風に理解されています。 話がそれましたが、まずはA-B-Cの同時複合体が存在することを証明しなければ抗B抗体がBにおけるC結合領域を認識している可能性を考えても先に進めないように思います。 A-B-C複合体の存在が既に明確に示されているのであれば筋違いの意見になりますが、ご容赦ください。

(無題) 削除/引用 No.1327-5 - 2009/10/11 (日) 07:05:28 - おお 元祖APさんでしょうか、、、、 APNo2さんでしょうか、、、、 えっと私のラボでやっている蛋白でタグ好きボスが GFPタグとFLAGタグをつけたタンパクの相互作用をみようとして、 たしかGFPでおとしてフラッグで検出されるが、逆で検出されない というのがありました。 扱っているたんぱく質は10個以上のタンパクでコンプレックスを 作っていて直接的なコンタクトがあるかは微妙です(ないと思っている のですがあるというボスの妄想で始まったと記憶していますが、、、) FLAG側がコンプレックスの内側に隠れているイメージでいます。 マスクされるというのはどういうふうにイメージされているか わかりませんが、B-Cの結合に重要な部分を抗体が認識して いる可能せいがあるように思えます。 B-Cの結合のため抗体が物理的にアクセスできないとかです。 あるいはコンペティッションとかかかる可能性もあるかも しれません。 そのほか可能性があるとしたら抗体の結合によって構造が 変わるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.1327-4 - 2009/10/11 (日) 05:31:26 - mm TK-1さんの意見に全く同感です。 Protein interactionについて調べるとき、それがdirect bindingなのか何か他のproteinを介したindirect bindingなのか、証明するためには究極のところ、crystaligraphyしかないと思います。 他には、In vitro binding assayがありますが、これは結構ノンスペが多いのであんまり信用できないし、、、。 DirectかIndirectかという目で論文をサーチしてみると、はっきり証明しているものは少なく（crystaligraphyの論文になってしまいます）、後は、その蛋白をつぶしたり、「そのInteractionに必要な」elementをmutantを使って証明したりしてますが、それらは、DirectかIndirectかということについては証明はしていません。

(無題) 削除/引用 No.1327-3 - 2009/10/11 (日) 03:53:58 - TK−１ > ３つのタンパク質A,B,Cに対し、それぞれについての特異抗体はあり、 > たとえば（A-B-C）という順で相互作用しているとされていると想定しています。 > 現在取り組んでいるのは、(A-B)とCとの相互作用でして、 > 先日、A.B.Cの抗体を用いてIPしてWBをみたところ、 > 予想に反して、A抗体でのIPでCのバンドが見えたのに対し、 ABCが同じcomplexに入っていれば、それが隣同士であろうが、中に介在している蛋白あったとしても、A抗体でCが落ちてきても不思議ではないと思いますがいかがでしょうか。要は、どの程度複合体を維持できる形でlysateが作られたかによります。あまり厳しい条件であれば隣同士のものでもCoIPが不可能でしょうし、complexを維持できるような条件でやればcomplex全体をIPするでわけで、そこでどの順番にどうこうという話は出来ないと思います。 A-B-Cでくっついていても、Bとは全く関係ない分子が介在しても、A-Cが単純結合していても起こる現象だと思います。 > B抗体ではAはみえても、Cが見えないという結果でした。 > （B抗体はWBにはあまり向いていないので、未確認） > > この場合は、B-Cとの相互作用がB抗体ではマスクされてしまうのかとも思うのですが、 > そのような例はあるのでしょうか？ > ご存じの方がいらっしゃれば、教えてください。 可能性としては、BとCは同一のcomplexに含まれない、あるいはBの抗体のepitopeがB-C interactionでカバーされるので、Cとのcomplexに含まれるBが落とされていないってこともあると思います。polyclonal抗体でimmunogenが大きい場合、IPの時にどの部分が認識されているかはmappingでもしない限りわかりませんし、極端な話、同じロットの抗体でもIPとWBで認識部位が異なっても不思議ではないと思います。 はっきりと結論づけられる方法としては、究極はcrystaligraphyですが、それ以外ではBの蛋白をなくしたとき（KO細胞か高効率の RNAi）にAとCの共沈がみられなくなることを証明することくらいしかないと思います。それが言えれば、ある程度AとCのinteractionにBが必要という結論は出せると思います。ただそれでも、Bが間に入る必要があるのか、それともBがないと全体のComplexが維持できないのかを証明することはかなり難しいと思います。

抗体の認識部位と免疫沈降 削除/引用 No.1327-1 - 2009/10/10 (土) 19:10:02 - AP 免疫沈降(IP)で、ある種の複合体と、それとinteractする（とされる）因子との 相互作用を確認しようとしています。 ３つのタンパク質A,B,Cに対し、それぞれについての特異抗体はあり、 たとえば（A-B-C）という順で相互作用しているとされていると想定しています。 (A-B)、この相互作用は、すでに「各々の抗体でIPして別の抗体でWB」で、 示すことができています。 現在取り組んでいるのは、(A-B)とCとの相互作用でして、 先日、A.B.Cの抗体を用いてIPしてWBをみたところ、 予想に反して、A抗体でのIPでCのバンドが見えたのに対し、 B抗体ではAはみえても、Cが見えないという結果でした。 （B抗体はWBにはあまり向いていないので、未確認） この場合は、B-Cとの相互作用がB抗体ではマスクされてしまうのかとも思うのですが、 そのような例はあるのでしょうか？ ご存じの方がいらっしゃれば、教えてください。 B抗体の抗原としては、Ｂの全長をE.coliで発現したタンパク質を用いています。

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